1252紫外分光光度法快速测定小麦胚芽脂肪氧化酶活力

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1、1252紫外分光光度法快速测定小麦胚芽脂肪氧化酶活力作者：徐斌董英胡庆松余雅斌刘筠钧【关键词】紫外分光光度法小麦胚芽脂肪氧化酶活力　　　1引言　　小麦胚芽(WG)中的脂肪氧化酶(LOX)能催化氧化WG中的亚油酸，使WG短期内酸败变质。为延长保质期，常采用加热处理钝化LOX。为了最大限度地保护WG营养，加热温度和时间的选择尤为重要。而LOX活性的准确测定则是进行麦胚稳定化理论研究的基础。研究表明，底物溶液的透明度、反应缓冲体系pH、反应温度、底物及Tween浓度等因素均会影响测定结果。现有的测定方法的酶纯化过程繁琐。此外，不同来源的LOX的最

2、适pH和最适温度有着较大差异，应根据原料类型进行选择。为此，建立了一种改良的WG中LOX的检测方法，简单快速获得了透明的底物溶液，省去了粗酶液纯化的繁杂步骤。　　2实验部分　　2.1仪器与试剂DU800核酸蛋白分析仪(Beckman公司);BR4冷冻离心机(Jouan公司);pHS63B精密酸度计(上海雷磁仪器厂)。小麦胚芽(江南面粉公司);亚油酸标准品(Fluka公司);其它试剂均为分析纯。　　2.2样品制备取10g小麦胚芽，粉碎，加入100mL0.1mol/L醋酸盐缓冲液(pH4.5)，4℃下搅拌30min，悬浮液12000r/min

3、离心30min，获得酶提取液。用醋酸盐缓冲液稀释10倍，作为酶测定液。　　2.3底物的配制取111μL亚油酸，无水乙醇定容到10mL，取3.55mL，加入40μLTween20。减压蒸去乙醇，残余物溶解在50mL0.05mol/LNa2HPO4溶液中，1mol/LNaOH调pH至9.0。底物中亚油酸浓度为2.53mmol/L。　　2.4酶活的测定检测波长234nm，温度25℃;反应液：2.0mL缓冲溶液，200μL底物溶液，50μL粗酶液;参比液：2.0mL缓冲溶液，200μL底物溶液，50μL钝化处理的粗酶液。【关键词】紫外分光光度法小

4、麦胚芽脂肪氧化酶活力　　　1引言6　　小麦胚芽(WG)中的脂肪氧化酶(LOX)能催化氧化WG中的亚油酸，使WG短期内酸败变质。为延长保质期，常采用加热处理钝化LOX。为了最大限度地保护WG营养，加热温度和时间的选择尤为重要。而LOX活性的准确测定则是进行麦胚稳定化理论研究的基础。研究表明，底物溶液的透明度、反应缓冲体系pH、反应温度、底物及Tween浓度等因素均会影响测定结果。现有的测定方法的酶纯化过程繁琐。此外，不同来源的LOX的最适pH和最适温度有着较大差异，应根据原料类型进行选择。为此，建立了一种改良的WG中LOX的检测方法，简单快速

5、获得了透明的底物溶液，省去了粗酶液纯化的繁杂步骤。　　2实验部分　　2.1仪器与试剂DU800核酸蛋白分析仪(Beckman公司);BR4冷冻离心机(Jouan公司);pHS3B精密酸度计(上海雷磁仪器厂)。小麦胚芽(江南面粉公司);亚油酸标准品(Fluka公司);其它试剂均为分析纯。　　2.2样品制备取10g小麦胚芽，粉碎，加入100mL0.1mol/L醋酸盐缓冲液(pH4.5)，4℃下搅拌30min，悬浮液12000r/min离心30min，获得酶提取液。用醋酸盐缓冲液稀释10倍，作为酶测定液。　　2.3底物的配制取111μL亚油酸，

6、无水乙醇定容到10mL，取3.55mL，加入40μLTween20。减压蒸去乙醇，残余物溶解在50mL0.05mol/LNa2HPO4溶液中，1mol/LNaOH调pH至9.0。底物中亚油酸浓度为2.53mmol/L。6　　2.4酶活的测定检测波长234nm，温度25℃;反应液：2.0mL缓冲溶液，200μL底物溶液，50μL粗酶液;参比液：2.0mL缓冲溶液，200μL底物溶液，50μL钝化处理的粗酶液。　　3结果与讨论　　3.1底物在不同pH条件下的稳定性底物溶液分别用pH4.5～9.0的缓冲溶液稀释10倍，随着时间的延长，由于亚油酸

7、在酸性条件下溶解度下降，产生浑浊，由于光散射导致吸光度增大。pH值越低，吸光度变化速度越快;pH4.5时达0.19%。而pH8.0和9.0的底物溶液比较稳定，吸光度在2h内基本保持不变。选择pH7.0缓冲液稀释底物，每隔15min测定粗酶液酶活一次。由于亚油酸溶解度的下降，参与催化反应的底物量减少，导致同样的酶液LOX酶活力2h后测定值仅为初始值的69%。为此，本实验采用亚油酸Tween无水乙醇混合体系配制反应底物，使亚油酸完全溶解在Tween中，再通过滴加NaOH，能方便地获得透明的底物溶液。酶活测定时，在反应体系首先加入底物和所需p

8、H值的缓冲液，稳定5min，再加入待测酶液，能有效消除在中性和酸性缓冲体系下，亚油酸溶解度下降产生的误差。　　3.2底物浓度的优化将不同浓度(0.31～15mmol/L)的底物溶