第四章 克隆载体的特征及类型

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1、第四章基因克隆的载体质粒（plasmid）噬菌体或病毒DNA粘粒（cosmid）与噬菌粒人工染色体载体载体的功能及特征载体：携带外源DNA进入宿主细胞的工具。能够运载外源DNA片段（目的基因）进入受体细胞，具有自我复制能力，使外源DNA片段在受体细胞中得到扩增和表达，不被受体细胞的酶系统所破坏的一类DNA分子。第一节载体的功能及特征载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件载体应具备的条件有复制起点，在受体细胞中能自我复制，或整合到染色体DNA上随染色体

2、DNA的复制而同步复制；具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点；具有筛选转化子的选择性标记基因；分子量小，拷贝数多；具有较高的外源DNA的载装能力；安全，不含对受体细胞有害的基因，不会任意转入受体细胞以外的其它生物细胞中。自主复制型载体和附加载体的扩增方式载体的类型应用范围：克隆载体、表达载体。应用对象：原核载体、真核载体（酵母、植物和动物）、穿梭载体。构建来源：质粒载体、病毒或噬菌体载体、质粒DNA与病毒或噬菌体DNA组成的载体、质粒DNA与染色体DNA片段组成的载体。克隆载体(cloningvector)用于在受体

3、细胞中进行目的基因扩增的载体。一般具有较低的分子量、较高的拷贝数和松弛型复制子。表达载体(expressionvector)使目的基因在宿主细胞中得以表达的载体。可将重组体DNA导入适合的受体细胞，使所载的目的基因能够复制、转录和翻译。穿梭载体(shuttlevector)又称双功能载体，能在两种不同的生物体内复制的载体。同时具有细菌质粒的复制原点和真核生物可识别的病毒复制原点或酵母菌的自主复制序列(ARS)，它既能在原核细胞中扩增又能在真核细胞中复制和表达。主要用于原核细胞与真核细胞之间进行基因转移，通常是将载体和

4、待克隆的真核生物DNA片段先在细菌中克隆，再转移到真核细胞中表达，并可提高外源基因的表达效率。第二节质粒质粒的基本特征质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子；绝大多数的质粒是DNA型质粒常见于原核细菌和真菌中质粒DNA的分子量范围：1-200kb天然DNA质粒具有3种构型：共价闭合环状(cccDNA)、开环(ocDNA)和线性(lDNA)构型。Plasmidchromosome绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即cccDNA质粒质粒的基本特征1.质粒的自

5、主复制性质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制质粒DNA的复制受质粒和宿主细胞双重遗传系统的控制根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：严紧型复制控制的质粒1-5拷贝stringentplasmid松弛型复制控制的质粒10-60拷贝stringentplasmid质粒质粒的基本特征质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制–质粒DNA复制启动控制控制复制引物与模板的结合oriE.coliColE1plasmid复制方向rop（+）RopRNAIIRNAI3’5’5’3’RNAII是复制的正向调

6、节分子，RNAI是复制的负调节物质粒质粒的基本特征质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制–质粒DNA复制启动控制控制复制起始因子与复制起始位点（ori）的结合PcopcopP/OrepreporiCopRep质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系质粒质粒的基本特征2.质粒的不相容性任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质以大肠杆菌的质粒为例：ColE1、pMB1拥有相似的复制子结构，彼此不相容p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容粒

7、组成不相容性群。亲缘关系密切的质粒；野生型质粒与其衍生的重组质粒。质粒质粒的基本特征质粒的不相容性：分子机制两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内(亲和性质粒)其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势质粒质粒的基本特征3.质粒的可转移性革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：接合型质粒能在天然

8、条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等如Col、R的其它成员非接合型质粒不能在天然条件下独立地发生接合作用值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质粒的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由bom和mob基因决定由rec基因控制，使质粒整合到染色体基因组上。在基因工程应用的是重组缺陷型（re