酵母转化(陈晗俊)..

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1、酵母转化(一)原理：我们采用的是PEG/LiAc法转化酵母。PEG是一种高分子聚合物,只有分子量达到3000左右的PEG才会发挥最大的转化促进作用。本文使用的PEG分子量为3350,实验结果表明促转化效果可以达到103～105cfu/μg。PEG在酵母转化中起到在高浓度醋酸锂环境中保护细胞膜,减少醋酸锂对细胞膜结构的过渡损伤,同时促进质粒与细胞膜接触更紧密。PEG的浓度是务必适宜,这一点很重要。LiAc可使酵母细胞产生一种短暂的感受性状态,此时它们能够摄取外源性DNA。鲑鱼精担体DNA为短的线形单链DNA,在

2、转化实验中主要是保护质粒免于被DNA酶降解;另外还可能在酵母细胞摄取外源性环形质粒DNA中发挥协助作用。在每次使用前务必进行热变性,使可能结合的双链DNA打开,保证鲑鱼精担体DNA在转化实验体系中以单链形式存在(二)材料、仪器设备及试剂：1.SD培养基：lYNB：1.6g/Ll硫酸铵：5g/Ll氨基酸：根据质粒的筛选压力选择性添加l调节pH=5.8，121°灭菌15min2.YPDA培养基l胰蛋白胨20g/Ll酵母浸膏10g/Ll琼脂20g/L(固体)l腺嘌呤15ml0.2%腺嘌呤/Ll调节pH=7.5，12

3、1°灭菌15min3.0.9%NaCl（w/v）lNaCl:0.9glmilipore水定容到100mll灭菌121°，20min4.100%DMSO从试剂瓶中分装到ep管中，500ul每管，室温保存5.10×TE（pH=7.5）：（0.1MTris-HCl，10mMEDTA）lTris-HCl1.211g/100mllEDTA0.37g/100mll调节pH=7.5,121°，20min6.10×LiAc（pH=7.5）l1MLiAc10.202g/100mll用醋酸调节pH=7.5，121°灭菌20min

4、1.1.1×TE/LiAclTris-HCl11ml10×LiAc（pH=7.5）/100mllEDTA11ml10×EDTA（pH=7.5）/100mll调节pH=7.5,121°，20min2.50%PEG3350：lPEG3350：50gl已灭菌的milipore水：定容到100ml（可用50°水浴助溶，PEG易吸水，不可灭菌）3.PEG/LiAc：现配现用，在超净台中操作，吸取母液到ep管或50ml离心管中终浓度10mlPEG335040%8ml50%PEG3350TEbuffer1×1ml10×TE

5、LiAc1×1ml10×LiAc4.变性的鲑鱼精DNA(10mg/ml)5.milipore水，70%酒精棉球，50ml离心管4个，ep管一盒，15ml试管架，50ml试管架，ep管架(一)具体方法：uA：酵母感受态制备1.从平板上或保种管中，挑少许酵母，在YPDA平板上划单克隆，30°培养3天左右。2.从平板上分别挑取单克隆（直径2-3mm）到含有3mlYPDA的玻璃试管中（平行做3管）3.30°，250rpm，培养8-12h4.取200ul菌液，测OD6005.选取OD600值最大的一个试管（即活力最高的

6、一个），吸取5ul转移至50m新鲜的YPDA培养基中（培养基装在250ml三角瓶中）6.30°，230rpm，培养16-20h，直至OD600=0.15-0.37.将培养好的菌液转入2个50ml离心管，室温离心3000g，3min，弃上清，用100ml新鲜的YPDA悬起管底的菌体，并倒入干净的三角瓶中。8.30°，230rpm培养直到OD600=0.4-0.5（3-5小时）9.将菌液倒入2个50ml离心管，室温离心，3000g，3min，弃上清，每个离心管用30mlmilipore水重悬。10.再次离心，30

7、00g，3min，弃上清，每管用1.4ml1.1×TE/LiAc重悬。11.将重悬的菌液转移到2个ep管中，12000rpm，15s12.弃上清，每管用600ul1.1×TE/LiAc重悬，将两管重悬菌液并入一管，准备进行转化。uB：酵母质粒转化小规模转化大规模转化1.加入质粒DNA100-500ng3-5ug鲑鱼精DNA(变性的，10mg/ml)5ul20ul加入感受态细胞,轻弹混匀50ul600ul1.加入PEG/LiAc,轻弹混匀500ul2.5ml2.30°水浴，每10-15min轻弹混匀30min4

8、5min3.加入DMSO,轻弹混匀20ul160ul4.42°水浴，每5-10min轻弹混匀15min20min5.离心，弃上清最大转速3000g15s3min6.用液体YPDA培养基重悬1ml3ml7.30°，230rpm，培养90min90min8.离心，弃上清最大转速3000g15s3min9.用0.9%NaCl重悬1ml15ml10.涂板在相应的筛选培养基上。(一)注意事项：1.转化效率与很