山羊卵巢无腔卵泡卵母细胞的体外生长

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1、山羊卵巢无腔卵泡卵母细胞的体外生长山羊卵巢无腔卵泡卵母细胞的体外生长山羊卵巢无腔卵泡卵母细胞的体外生长山羊卵巢无腔卵泡卵母细胞的体外生长山羊卵巢无腔卵泡卵母细胞的体外生长山羊卵巢无腔卵泡卵母细胞的体外生长山羊卵巢无腔卵泡卵母细胞的体外生长山羊卵巢无腔卵泡卵母细胞的体外生长山羊卵巢无腔卵泡卵母细胞的体外生长第19卷第3期中国兽医1999年5月ChineseJournalofVeterinaryScienceVol_19,MayNO.31999—旦.墨苎(内蒙古农牧学院动物科学系,呼和浩特010018)兰—至一一西北农业大学发育生物学研究室摘要山羊卵

2、巢无腔卵泡卵母细胞在以DMEM为基础,添加HEPES(20mmol/I),FCS(10),FSH(40mg/I),次黄嘌呤(2mmol,L),异双丁酰环腺苷酸(2mmol/I,),IGF—I(50g/1),氢化可的橙(40/I)和ITS(50/I)的培养液中得以存活井生长.在二维培养体系中,卵泡在体外的生长模式和体内有很大差别.最显着的特征是卵泡不像在体内那样保持完整的立体结构一直到结束绝大部分卵泡不同程度地发生基膜溶解和破裂,颗粒细胞向四周扩展并贴壁,形成单层.由于卵泡原有三维立体结构的破坏,易于导致卵母细胞的迁移.在生长方式上以致个卵泡聚集生

3、长对其卵母细胞的生长似乎较为有利.卵泡卵母细胞在体外培养9d,其直径可达150/tin以上,达到r成热时体积,存活率为53.实验证明,山羊无腔卵泡卵母细胞在合适的培养体系中,能在体外存活并生长,并能发育到成热时的大小关键词山羊无腔卵泡卵母细胞体外生长中圈分类号$827.36Q954.432啮齿动物无腔卵泡卵母细胞的体外培养体系已基本建立],并在小鼠获得了后代].但家畜卵巢无腔卵泡卵母细胞的体外培养仍处于探索阶段.对牛_9和猪[113的无腔卵泡卵母细胞的体外培养研究表明,家畜无腔卵泡卵母细胞在体外条件下也具有发育能力,但在山羊这方面研究尚属空白.本

4、研究采用二维培养法培养山羊卵巢无腔卵泡卵母细胞,以期建立其体外发育的培养体系,认识山羊卵泡卵母细胞的体外发育过程和规律,为其体外成熟研究直至利用奠定基础.1材料与方法1.1无腔卵泡的分离卵泡取自当地60日龄前沙能奶山羊卵巢.将卵巢切碎(1～2ram),置于0.1胶原蛋白酶(typeⅣSIGMA)和4OU/mLDNA酶(华美生物工程公司)混合消化液内,于38.5C,5CO2,1OO湿度的培养箱内消化20--:-25min.在消化的中途和结束,以直径略大于组织块的玻璃吸管各悬浮2O次左右,再以DMEM收稿日期:1998—09-l5第1作者:局欢敏.男

5、,1959年生,博士.剐教授*农业郡生物技术重点项目(95牧-01—04—01)3:1稀释后转入4C慢消化1O～15min,之后离心(1000r/min)2～3次,洗去消化酶,再经网筛(450脚)过滤后拣卵.1.2无腔卵泡的选择将分离出来的各级卵泡转移到含适量DMEM培养液的表面皿内.选择正常完整的直径≤150/urn,卵母细胞直径≤9Om的卵泡(图1A),在DMEM培养液中洗涤2～3次,再转移到含新鲜培养液的表面皿内,置于co培养箱内备用.1.3无腔卵泡的培养1.3.1培养液以DMEM为基础,添加不同的培养成分:DMEM+20mmol/LHEP

6、ES+10FCS+2mmol/L次黄嘌呤+2mmol/LdbcAMP+0.23mmol/L丙酮酸钠+40mg/LFSH+50g/LITS+50ug/LIGF—I+40,ug/L氢化可的松+75/L青霉素+5O/L链霉素1.3.2二堆培养体系采用微滴法培养每个塑料培养皿(3.5cm)铺5个微滴,每个微滴100L.每个微滴接种5～1O枚卵泡,上盖矿物油后,置于cO2培养箱内培养(38.5C,5%COz,100湿度).于培养的第2天换新鲜培养液,每次换液2/3,以后每隔3d换液1次.1.4无腔卵泡的测量在卵泡培养之前,测定其302中国兽医I999年大小

7、,此时作为卵泡生长的0时,其大小即为卵泡的0时体积从培养的0时起,于培养的第3天和第9天分别各测定1次,在相差显微镜下,卵泡两端基膜外缘最大距离代表卵泡的直径,卵母细胞两端最大距离为卵母细胞的直径,包括透明带.1.5培养卵泡的鉴定正常发育的卵泡,其卵母细胞呈圆形,位于卵泡的中央或略偏于一侧.胞质均匀,色泽鲜明,具有健康的透明带,薄厚均匀一致.颗粒细胞联系紧密,圆而光滑,不过早脱离卵母细胞.凡卵母细胞变形,过暗或过淡,透明带严重变形,颗粒细胞过早脱离均视为退化.1.6统计分析试验数据经统计分析,作}检验.2结果2.1山羊无腔卵泡的体外生长特征二维培

8、养条件下,无腔卵泡的体外生长和体内生长方式存在很大差异.在培养的24h或48h内,卵泡的基膜出现溶解,其特征表现为在卵泡的周边出现一层透