实验十五固定化酵母细胞发酵蜂蜜酒

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1、实验十五固定化酵母细胞发酵蜂蜜酒一、实验目的1.学习固定化酵母细胞的方法。2.掌握蔗糖酶活力的检测方法。二、实验原理固相酶又称为固定化酶，是通过物理及化学的处理方法，使水溶性酶和固态的水不溶性支持物(或载体)相结合而制备的。通过酶的固定化可以将酶转变成不溶物同时仍保留酶的活力，在催化反应中具有诸多水溶性酶所不具备的优点。常用的酶的固定化方法主要有：1.物理吸附法；2.载体偶联法(键结合法)；3.交联法；4.包埋法；就其应用技术而言，又分为固定化酶和固定化细胞二种。相对于水溶性酶，固定化酶的优点主要是机械强度增加，稳定性提高，可回

2、收反复使用。三、仪器和试剂仪器试管、1毫升吸管4支、水浴锅、精密酒精计：分度值为0.1%vol、全玻璃蒸馏器：500mL、高精度恒温水浴：20.0±0.1℃。试剂1.海藻酸钠若干克；2.K号酵母液；3.10％蔗糖液：称取10克蔗糖用水定容至100毫升；4.斐林试剂。四、操作步骤l、称取海藻酸钠1克加入100毫升水中，微火加热溶解后冷却到30℃左右，将预先准备好的3克卡氏酵母(或K号酵母的培养液30毫升)的悬液加入混匀。然后倒入下边装有胶管与止血夹的漏斗中，让其慢慢滴入4％氯化钙溶液中，制成直径2－3毫米的球形固定化酵母。将此固定

3、化酵母装入柱中，从柱上端加入10％的蜂蜜溶液，控制一定的流速，且注意室温要在25~28℃。2、24小时后测定流出液中的还原糖含量和酒精度。（1） 葡萄糖测定   空白液测定：吸取斐林试剂甲、乙液各5ml，置入150ml三角瓶中，加空白液5ml，并用滴定管预先加入适量的0.1%标准葡萄糖溶液，使后滴定时消耗0.1%标准葡萄糖溶液在1ml以内，加热至沸，立即用0.1%标准葡萄糖溶液滴定至蓝色消失，此滴定操作在1min内完成。糖化液测定：准确吸取5ml糖化液代替5ml空白液，其余操作同上。（2）酒精度的测定A蒸馏在20℃±5℃的工作条

4、件下，进行该试验。用一洁净、干燥的100mL容量瓶准确量取100.0mL样品（液温20℃）于500mL蒸馏瓶中，用50mL水分三次冲洗容量瓶，洗液并入蒸馏瓶中，再加几颗玻璃珠，连接冷凝器，以取样用的原容量瓶作接收器（外加冰浴）。开启冷却水，缓慢加热蒸馏。收集馏出液接近刻度，取下容量瓶，盖塞。于20℃水浴中保温30min，补加水至刻度，混匀，备用。B酒精度的测定将蒸馏液（注入洁净、干燥的量筒中，静置数分钟，待酒中气泡消失后，放入洁净、擦干的酒精计，再轻轻按一下，不应接触（文章来源：华夏酒报·中国酒业新闻网）量筒壁，同时插入温度计，

5、平衡约5min，水平观测，读取与弯月面相切处的刻度示值，同时记录温度。根据测得的酒精计示值和温度，查表，换算为20℃时样品的酒精度（所得结果应表示至一位小数）。五、思考题1.固定化细胞的方法有哪些？2.细胞固定化时选择哪一时期的细胞较好？附录一酵母原生质体融合试验用培养基(包括酵母单倍体原生质体融合及电场诱导酵母原生质体融合）1.完全培养基葡萄糖2g蛋白胨2g酵母膏1g蒸馏水100mLpH7.2100Pa灭菌20min。如需配成固体完全培养基时，则需在上述液体培养基中加入2％琼脂。2.基本培养基(用于单倍体酵母原生质体融合试验)

6、(1)葡萄糖柠檬酸钠培养基葡萄糖0.5g(NH4)2SO40.2g柠檬酸钠0.1gMgSO4·7H2O0.02gK2HPO40.4gKH2PO40.6g纯化琼脂2g蒸馏水100mLpH6.0100Pa灭菌20min。(2)YNB培养基葡萄糖2g酵母氨基(YNB)*0.67mL琼脂(经纯化处理)2.0g蒸馏水100mLpH6.0100Pa灭菌20min。3.再生完全培养基在固体完全培养基中加入0.5mol/L蔗糖（或0.8mol/L甘露醇或1mol/L山梨醇）。4.基本培养基（用于电场诱导酵母原生质体融合试验）葡萄糖2g酵母氨基(

7、YNB)*0.67mL琼脂(经纯化处理)2.0g蒸馏水100mLpH6.0100Pa灭菌20min。*YNB培养基由以下A、B、C三种溶液混合而成，取A1mL，B1mL，C10mL，无离子水1000mL，pH6.5。A液维生素混合液VB11000mg，箊酸400mg，吡哆醇400mg，生物素20mg，泛酸钙2000mg，VB2200mg，肌醇10000mg，对氨基苯甲酸200mg，无离子水l000mL。B液微量元素混合液H3BO4500mg，MnSO4·7H2O200mg，ZnSO4·7H2O400mg，CuSO4·5H2O40

8、mg，FeCl3·6H20100mg，Na2MnO4200mg，无离子水1000mL。C液其他无机盐KI0.1mg，CaCl2·2H2O0.1g，K2HPO4附录二白酒勾兑常用计算基本概念1.“容量%”即白酒（酒精）中纯酒精占容量百分数，亦即统称的酒度。例如：6