检测自身免疫抗体的蛋白质芯片技术

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1、检测自身免疫抗体的蛋白质芯片技术磁性微粒的扫描电子显微照片，由Bio-RadLaboratories公司(美国加州，Hercules)的BioPlex2200免疫测定系统（该设备具多路复用测定功能）采用。自身免疫性疾病是由异常免疫反应引起的慢性退行性或炎症性疾病。不同的自身免疫性疾病对机体的影响各有不同。例如，在多发性硬化症中，自身免疫反应的侵害对象是中枢神经系统，而在克罗恩病中则是肠道。此外，同种疾病对不同个体的组织和器官的影响程度不尽相同。此类疾病的严重程度取决于患者的免疫系统情况。其人群患病率在3%以上，女性和老年人居多。炎症是许多此类疾病的常见症状，其他症状包括：眩晕、疲劳、不

2、适及低烧。器官特异性自身免疫性疾病可侵害靶器官或组织，导致功能受损。对此类疾病的诊断相当困难，尤其是在发病初期。对健康个体进行的特异性自身抗体检测表明：不同疾病的阳性结果发生率少则接近0%，多则超过10%。健康个体中的大多数抗体的滴定浓度都很低，对健康没有不良影响。自身抗体并不总是针对某种风湿性疾病。例如，与天然双链DNA(dsDNA)发生反应的抗体通常对系统性红斑狼疮(SLE)具有诊断意义。但是，抗双链DNA抗体也可见于患有其他疾病的个体中，如风湿性关节炎、干燥综合症、硬皮病、药物性狼疮、慢性活动性肝炎、格雷夫斯氏病及其他疾病。抗双链DNA抗体在上述疾病的患者中发生率一般低于5%。因

3、此抗双链DNA抗体对SLE没有诊断意义。在少数情况下，自身抗体具有很强的疾病特异性。目前已鉴别出一些常见风湿性疾病的自身抗体靶点（表I）。本文就自身抗体检测技术进行了回顾性评述，开篇先介绍一些成熟的检测方法，最后则展望未来的发展趋势。多路复用蛋白质分析技术是讨论的核心焦点。本文还研究了各种多路复用自身免疫测定法，并阐述了开发人员所面临的困难。目前的检测方法检测自身免疫相关抗体的第一种方法是琼脂凝胶平板双向扩散法，但是这种方法早已被更快速、更灵敏的半定量方法所取代。检测血清中自身抗体的常用实验室试验：免疫测定（通常为酶免疫测定）、间接免疫荧光显微技术(IFA)、免疫印迹及免疫沉淀。上述试

4、验中只有第一种是半定量试验；其他均为定性试验。通过IFA法进行筛查需要耗费大量的人力，而且要求训练有素的技术人员对显微镜染色图谱进行目测解读。这种方法缺乏可靠的标准，其结果取决于观察者的技能。IFA阳性结果并不能确定抗原的存在。因此，在提出具体治疗方案的建议方面，其作用十分有限。疾病最常见的抗原系统性红斑狼疮双链DNA、Sm抗原、抗核抗原干燥综合症干燥综合症A抗原(52和60kDa)和B抗原(SSA和SSB)、抗核抗原系统性硬化症拓扑异构酶I、着丝粒蛋白B、抗核抗原类风湿性关节炎类风湿因子、环瓜氨酸肽格雷夫斯氏病促甲状腺激素受体原发性胆汁性肝硬化线粒体蛋白重症肌无力乙酰胆碱受体慢性特发

5、性血小板减少性紫癜血小板抗原1型糖尿病胰岛β-细胞抗原表I.针对某些主要风湿性疾病最常用的自身免疫分析技术。这些方法的最大缺陷是每次分析只能获得一个结果。通常，为了获得完整的自身抗体检测结果，需要进行多次试验。长期以来，研究人员希望能够同时检测同一类别的多种分析物，如自身抗体、过敏原及甲状腺功能试验，而多路复用技术的出现使这一目标得以实现。采用多路复用分析技术时，一份样品可以在同一个反应器中产生多个报告结果。多路复用技术非常适用于多因素疾病的诊断，这种疾病需要进行多种实验室检测方能做出诊断。以复合模式（多路复用技术）对合理设定的多种分析物进行分析具有许多优点：·节约试剂、实验室耗材以及

6、劳动力成本，特别是劳动力成本。·通过病人的少量标本即可获得大量信息，这一点对于儿科尤为重要。·能够同时检测核酸、抗原、抗体及药物等多种分析物。·具有内部质量控制功能，确保试验结果的准确性。·样品处理量增大。·能够鉴别分析物浓度的图谱。另外，多路复用技术适应了当今工业和市场的发展趋势，即：劳动力短缺、自动化程度提高、过程标准化以及实验室联合。芯片技术多路复用蛋白质分析技术最近研制成功，主要包括两种子技术：平板芯片和球形芯片。图1.某试验中所用的二维芯片的布局示意图，该芯片内含14种自身抗原(A–N)、阳性(+)和阴性(–)对照以及IgG校准品，不同位置上校准品的浓度以两倍的速度从1mg/

7、ml(C1)递增至16mg/ml(C5)。平板芯片：该技术采用一块二维微芯片，芯片内含针对各种分析所定义的反应位点。通过可溶阶段的配合基，平板芯片可以对蛋白质、代谢物及其他分子组成的混合物中的几种固定化蛋白进行同时检测。几年前，某研究小组制造了一种内置1152个反应位点的自身抗原芯片。这种平板芯片采用聚左旋赖氨酸包被的玻璃载玻片作为固体载体。将196种不同的假定自身抗原以4个或8个复制组的形式进行点样，由此产生有序阵列。结合在固体基质上的蛋白质