gst_pull_down试验方法(自己总结)

《gst_pull_down试验方法(自己总结)》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、12.GST蛋白的表达和纯化12.1GST蛋白的表达（1)将表达GST融合蛋白的质粒转入BL21大肠杆菌菌株中。（2)挑单克隆于3mlLA(LB+Amp)培养基中，37℃摇菌过夜，获得种子液。（3)将种子液稀释于50ml2XYTA(YTG+Amp)培养基中，使起始OD600为0.1。（4)28℃,220rpm摇菌培养2小时。（5)加入50μl100mMIPTG,16～27℃摇菌培养1～8小时。（6)收菌，将菌液倒入大离心管，2管/50ml菌液，4℃5krpmx5min离心，弃上清。（7)加入10ml

2、PBS/管，重悬细胞,5krpm离心5min，弃上清。（8)加入2ml　PBS/管，重悬细胞。转移至5ml离心管。（9)超声破壁破壁前，在细胞悬液中加20μl10mg/mlPMSF,80μl蛋白酶抑制剂(100x)。破壁参数：Frequency:100～200w　60s，pause　20srun40s,5cycles破至菌体由浑浊变为澄清。加100μl20%　TritonX－100，冰上放置30min。（10)将裂解液分入1.5ml离心管中，4℃离心12krpm×10min，取上清。（11)吸取少量

3、上清，加入蛋白电泳上样缓冲液，在沸水中煮3min。离心（12krpm,1min），取上清作SDS-PAGE电泳，检测表达情况。12.2准备50%GSTSepharose4Bslurry（1)将原75%GlutathioneSepharose4B的slurry弹至混匀。（2)取677μl原液/管，3krpm离心5min，弃上清。（3)加500μl　PBS，颠倒混匀，3krpm离心5min，弃上清。反复5次。（4)加500μl　PBS，颠倒混匀，配成50%GlutathioneSepharose4B备用

4、。12.3GST融合蛋白的纯化（1)在新鲜制备的细胞裂解液上清中加入20μl50%GlutathioneSepharose4B，4℃，摇床上摇，反应30min～60min。（2)3krpm离心5min，弃上清。该Sepahrose上即结合了GST融合蛋白，（如果仅仅是做纯化效果检测或者蛋白表达量很高，可以只接合一次，如果要结合更多则接着往下做）（3)在管中加入离心后的1.5ml新鲜制备的细胞裂解液的上清，4℃，反应30min～60min。3krpm离心5min，弃上清。重复该步骤多次，就可以使Sep

5、ahrose上结合6～10ml裂解液中的GST融合蛋白。（4)在管中加入预冷的200μl　PBS（沿壁加入，小心勿剧烈，以免打断珠子与蛋白的联接）,轻晃悬浮珠子，将Sepharose洗涤一次，3krpm离心3min，弃上清。（5)反复三次（最后一次以小枪吸净珠子表面水膜，其余几次可以中枪吸，尽量吸净但不吸走珠子），即获得结合有GST融合蛋白的Sepharose。（6)如果用于检测，在Sepharose加入15～20μl1×蛋白电泳上样缓冲液，在沸水浴中煮3min。12krpm离心1min，取上清作S

6、DS-PAGE电泳。（7)如果用于pull－down测试，参见pull－down步骤。14.体外蛋白质结合分析（GST-pulldown）（1)将结合有GST融合蛋白的GlutathioneSepharose4B悬浮在500μlNETN缓冲液中加入20～30μl含有其他蛋白的溶液，例如pET发酵的产物,细胞表达的产物等，同时采用结合有GST空蛋白的GlutathioneSepharose4B平行操作作为对照。（2)在水平摇床上，4晃动4～8小时。（3)离心（3.6krpm,2min）。吸去上清，注意

7、不要扰动底层的Sepharose.（4)加入200μl缓冲液H对Sepharose进行洗涤。注意加入缓冲液H时要贴壁加，不要直接冲击Sepharose，随后轻柔晃动，使Sepharose重悬即可。（5)低速离心（3krpm，2min）吸去上清，注意不要扰动底层的Sepharose。（6)重复步骤的洗涤2～3次。（7)吸干Sepharose上方的水层后，加入20～30μl1×蛋白电泳上样缓冲液，沸水浴4min，冻存于－20℃。（8)做SDS-PAGE和Western检测另一个蛋白。GST试验流程（梗概

8、）：（1）Glutathione琼脂糖珠预处理。（2）GST融合蛋白挂柱：取适量GST-融合蛋白与10μl已经处理过的beads置于1.5ml离心管中，4℃,摇床孵育过夜。（3）孵育过夜的蛋白质与beads的混合液于4℃,500g离心5min，上清收集，观察融合蛋白是否饱和地挂在beads上，用1ml冰冷的细胞裂解缓冲液洗三次beads。（4）把转染目的基因的细胞（5×106）裂解在0.5ml细胞裂解液里（含蛋白酶抑制剂），最大转速4℃离心20min,收集上清液。（5