基因活化的仿生生物材料促进骨再生的实验研究

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1、基因活化的仿生生物材料促进骨再生的实验研究　　摘要：目的与方法制备整合VEGF和/或BMP基因的壳聚糖/胶原支架，观察该组织工程支架的对人骨髓间充质细胞增殖、成骨向分化的影响，并比较整合不同生长因子的组织工程支架在种植体周围骨缺损模型中成骨的差异。结果培养于整合有BMP腺病毒的支架上的骨髓间充质细胞细胞ALP活性明显高于其他组，MTT检测支架对细胞增殖无影响。植入体内种植体周围缺损实验中，组织形态学结果显示，整合了BMP-2腺病毒的支架的骨形成量均多于未整合BMP-2腺病毒的支架，并且同时整合VEGF蛋白和BMP-2腺病毒的支架相结合的骨生成量最高。结论整

2、合病毒以及生长因子蛋白的支架生物相容性好，不影响细胞在支架上的增殖。整合VEGF蛋白和BMP-2基因的支架在促进骨愈合中具有有协同效应。　　关键词：血管内皮生长因子VEGF；BMP-2；骨再生　　据估计，全世界每年有2.2万的骨科、神经外科及口腔科患者因骨缺损行骨移植手术。目前常见的骨移植材料有自体骨、同种异体骨、脱矿化骨基质、异种骨、合成材料、组织工程产品等。自从灭活骨、脱钙骨能够诱导异位骨再生的现象被发现以来，科学家们认识到蛋白在诱导骨再生中起到关键作用，基于生物活性分子的骨组织工程成为研究的热点。骨是高度血管化的组织，血管生成对骨再生至关重要。缺乏血

3、管生成会导致骨再生中骨形成和骨总量减少。新生的血管对于营养供应、分子信号的传输和干细胞的运输十分重要。血管生成对骨再生的意义重大，众多学者尝试利用促进血管生成的因子与骨再生的因子结合共同促进骨愈合。本研究试图利用VEGF与BMP-2制备基因活化的仿生生物材料，观察其对骨缺损的愈合中的促进作用。　　1资料与方法　　1.1实验分组实验分为5个组，包括：纯壳聚糖/胶原支架，记为G1（group1）；整合BMP-2腺病毒的壳聚糖/胶原支架，记为G2（group2）；整合VEGF腺病毒的壳聚糖/胶原支架，记为G3（group3）；整合BMP-2腺病毒和VEGF腺病毒

4、的壳聚糖/胶原支架，记为G4（group4）；以及整合BMP-2腺病毒和VEGF蛋白的壳聚糖/胶原支架，记为G5（group5）。　　1.2壳聚糖胶原支架的制备及复合病毒将壳聚糖用0.5mol/L乙酸配成2%（w/v）的溶液，将胶原按2%比例溶解于壳聚糖溶液中，磁力搅拌48h后注入培养皿，4℃下放置30min，-35℃放置过夜，最后-80℃放置2h成型后移入冷冻干燥机冻干，48h后干燥完成。支架在接种细胞或病毒前需灭菌，具体步骤如下：先以0.3MNaOH的溶液中和材料中的乙酸，然后75%乙醇浸泡12h，大量PBS冲洗去除残余乙醇，紫外线照射30min。　　

5、将壳聚糖/胶原支架切块。在无菌操作台内，将病毒液滴于支架上，使之浸润，具体量为：对于G2，G3组，1ml的腺病毒溶液滴到1mg的干燥的壳聚糖/胶原支架上，4℃过夜使支架与质粒或腺病毒充分结合，然后-80℃放置2h成型后移入冷冻干燥机干燥。对于G4组，Ad-BMP-2与Ad-VEGF病毒液等体积混合后，吸取1ml滴到1mg壳聚糖/胶原支架上，4℃过夜使支架与质粒或腺病毒充分结合，然后-80℃放置2h成型后移入冷冻干燥机干燥。对于G5组，将2mgVEGF-D蛋白溶解于2ml的灭菌的去离子水中，获得的终浓度为浓度为1mg/ml，将2ml溶液滴于干燥的壳聚糖/胶原

6、支架上，再将1ml的Ad-BMP-2病毒溶液滴到1mg的干燥的壳聚糖/胶原支架上，所获得的支架为每1mg支架有2mgVEGF蛋白及1mlAd-BMP-2病毒液；4℃过夜使支架与质粒或腺病毒充分结合，然后-80℃放置2h成型后移入冷冻干燥机干燥（图1示冷冻干燥机及干燥过程）。　　1.3整合不同生长因子的支架对骨髓间充质细胞增殖分化影响的相关研究MTT法检测支架材料对骨髓间充质细胞增殖的影响。将五种支架各选4块置于24孔板内，第四代骨髓间充质细胞消化后，以1×105细胞的密度接种于支架，每个支架100μl细胞悬液。3h后添加150μl10%FBS的DMEM培养

7、液继续培养，分别在1、3、7d检测细胞增殖活性。　　ALP检测：接种方法同前，3h后添加900μl10%FBS的DMEM培养液继续培养，分别在7d和14d检测ALP活性。具体方法如下：7和14d后，取上清液，80μl的上清加20μl的0.5M的AMP，然后加入100μl底物，混匀后37°孵育1h。取50μl上清，按碱性磷酸酶试剂盒说明书在405nm波长下测ALP活性。根据换算出的每孔细胞的ALP值和DNA的总量的比值来计算每孔细胞的ALP活性，单位是nmolesparanitrophenol/ngDNA/min。　　1.4骨缺损修复的观察选取6只2岁大的中

8、华田园犬，手术在全麻下进行。局部消毒后，拔除下颌前磨牙，清理牙槽窝