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11种中药对小鼠淋巴细胞活性及腹腔巨噬细胞功能的影响【关键词】黄芩；,,蒺藜；,,罗布麻；,,淋巴细胞；,,巨噬细胞, 摘要：目的研究具有免疫调节作用的11种中药水提取物，对小鼠脾淋巴细胞增殖活性以及腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响。方法采用体外检测不同浓度的11种中药水提取物对正常、ConA及LPS诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖作用的影响，运用中性红法检测巨噬细胞的吞噬功能。结果黄芩水提取物对正常淋巴细胞的增殖活性无明显影响，对ConA及LPS诱导的脾淋巴细胞增殖活性有显著的抑制作用，其IC50分别为16.54，19.00μg/ml；蒺藜及罗布麻水提取物能够显著促进巨噬细胞吞噬功能。结论黄芩水提取物对小鼠脾淋巴细胞增殖活性具有一定的调节作用，蒺藜及罗布麻对巨噬功能有一定的调节作用。 关键词：黄芩；蒺藜；罗布麻；淋巴细胞；巨噬细胞 Effectof11TraditionalChineseHerbsonProliferationofSplenicLymphocyteandFunctionPhagocytosisofPeritonealMacrophage Abstract：ObjectiveToinvestigatetheimmunemodulatoryeffectofwaterextractof11traditionalChineseherbsontheproliferationofspleniclymphocyteandfunctionphagocytosisofperitonealmacrophage.MethodsThepatternofconcanavalinA(ConA)orlipopolysaccharide(LPS)inducedproliferativeresponseofmurinelymphocyteswasassessed.CellproliferationwasmeasuredbytheXTT(2,3bis［24nitro5sulfophenyl］-2H-tetrazolium5carboxanilideassayinthenormalcellsandthecellstreatedwithConAorLPS,thenmeasuredtheproliferationaftertreatedwithwaterextractof11traditionalChineseherbs(Thefinalconcentrationofwaterextractof11traditionalChineseherbs:100.0，50.0，25.0，12.5μg/ml).PeritonealmacrophagestainedredwithNeutralRedDye.Thefunctionphagocytosisofperitonealmacrophageaftertreatedwithwaterextractof11traditionalChineseherbsfor12hourswasmeasuredbythedoseofNeutralRedDyethattheyingested.ResultsTheresultsshowedthattherewasnoeffectofwaterextractof11traditionalChineseherbsonnormallymphocytes.ThewaterextractofScutellariabaicalensishadnoticeableinhibitoryeffectonthelymphocytestreatedwithConAorLPS.TheinhibitionoftheproliferationoflymphocytestreatedwithConAafterexposuretoScutellariabaicalensiswasdose-dependent,its50%inhibitoryconcentration(IC50)was16.54μg/ml.Thecorrinhibitionratiowas41%,63%,70%,78%.TheinhibitionoftheproliferationoflymphocytestreatedwithLPSafterexposureto5 Scutellariabaicalensiswasdosedependent,too.ItsIC50was19.00μg/ml.Thecorrinhibitionratioswere42%,59%,64%,80%.ThewaterextractofTribulusterrestrisandBluishdogbaneenhancedperitonealmacrophagetoingesteNeutralRedDye,itmeantthatthewaterextractofthetwotraditionalChineseherbsreinforcedthefunctionphagocytosisofperitonealmacrophage.ConclusionThewaterextractofScutellariabaicalensispossessesthemodulatoryeffectonmurinelympholytes.ThewaterextractofTribulusterrestisandBluishologbanepossessestheimmunemodulatoryeffectonfunctionphagoaytosisofperrtonealmacrophage. Keywords：Scutellariabaicalensis;Tribulusterrestris;Bluishdogbane;Lymphocyte;Macrophage 糖尿病、原发性肾病、呼吸道变应性疾病、类风湿性关节炎等自身免疫性疾病是由自身组织抗原免疫应答过高或Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ型超敏反应引起的。其中淋巴细胞、巨噬细胞、NK细胞等，参与自身免疫组织损伤。其中T细胞可以直接或间接地攻击靶组织而造成组织的损害；而B细胞功能亢进亦可增加组织损伤。另一方面，免疫缺陷病、肿瘤的治疗则需要通过增强机体免疫功能以获得较好的治疗效果，巨噬细胞通过吞噬外来抗原和体内产生的抗原物质在免疫系统中发挥着重要作用。因此研究药物对淋巴细胞增殖效应及巨噬细胞吞噬功能的影响，具有重要的意义。本次实验目的是探讨蒺藜、黄精、大青叶、女贞子、连翘、何首乌、吴茱萸、紫草、罗布麻、黄芩、姜黄等11种据文献报道［1～6］具有免疫调节作用的中药对正常、ConA及LPS诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖作用及其腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响，为进一步探讨药物的免疫作用机理奠定基础。 1材料 1.1动物昆明种雄性小鼠，体重18～20g，由吉林大学动物实验中心提供，合格证编号20030001。 1.2试剂噻唑蓝(XTT)、刀豆蛋白A(ConA)、细菌脂多糖(LPS)（Sigma公司，美国）；RPMI1640、青霉素和链霉素为美国GIBCO公司产品；小牛血清为杭州四季青生物工程材料公司生产；PMS（ACROS，美国）；硫乙醇酸钠，国药集团化学试剂有限公司（中国，上海）；中性红购于上海试剂三厂。 1.3仪器680酶标仪由美国BIORAD公司生产；DGW99型台式高速微型离心机由宁波新芝生物科技有限公司生产；SWCJ2FD双人单面净化工作台由苏州净化设备有限公司生产；96孔培养板购于美国CorningIncorporatedcostar公司。 1.411种受试药的制备取蒺藜、黄精、大青叶、女贞子、连翘、何首乌、吴茱萸、紫草、罗布麻、黄芩、姜黄制备水提取物，浓缩后真空干燥。以无菌生理盐水配置成初浓度1mg/ml的溶液。5 2方法 2.1对小鼠脾淋巴细胞增殖能力的影响(XTT法)［7］常规制备小鼠脾淋巴细胞悬液，调整细胞数为5×106个/ml，接种于96孔培养板中，每孔100μl(每种样品设3复孔)。在中药对小鼠正常脾淋巴细胞增殖活性的影响实验中，设空白调零组、对照组、各受试药组；在中药对小鼠ConA诱导的脾淋巴细胞增殖活性的影响实验中，设空白调零组、ConA对照组、ConA+各受试药组；在中药对小鼠LPS诱导的脾淋巴细胞增殖活性的影响实验中，设空白调零组、LPS对照组、LPS+各受试药组。各实验药物的终浓度分别为100.0，50.0，25.0，12.5μg/ml，LPS终浓度为20μg/ml，ConA终浓度为20μg/ml。37℃，5%CO2培养箱孵育44h后，每孔中加入60μl新鲜配置的XTT-PMS溶液，继续培养5h后，振荡5min，用酶标仪在450nm(605nm作为参比波长)波长下测定OD值。计算增殖指数(proliferationindex，PI)=实验组OD值/对照组OD值，并计算受试药物对细胞的抑制率或增殖率，增殖率=（PI－1）×100%（PI＞1），抑制率=（1－PI）×100%（PI＜1）。 2.2对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响［8］常规制备小鼠巨噬细胞悬液，调整细胞浓度为2×106个/ml，接种于96孔培养板(100μl/孔)。37℃，5%CO2培养箱孵育12h。待细胞贴壁后，移去培养液，向96孔板巨噬细胞中加入不同浓度药物（11种受试药物）及PBS磷酸缓冲液（对照组）10μl，再加入RPMI1640培养液100μl，于37℃培养24h。弃上清液，每孔加入0.08%中性红生理盐水溶液100μl继续培养30min。弃上清，用PBS洗涤3次，每孔加入细胞溶解液酸性乙醇溶液（冰醋酸1ml和100ml50%乙醇），静置过夜。在490nm波长下测定OD值，并计算吞噬指数=实验组OD值/对照组OD值。 2.3统计学处理运用SPSSl3.0统计软件统计学分析各组实验结果，所有数据以±s表示，并计算IC50值。 3结果 3.1中药对小鼠正常脾淋巴细胞增殖活性的影响结果见表1。从表1可以看出，11种受试中药对正常淋巴细胞增殖均无明显影响。 3.2中药对小鼠ConA诱导的脾淋巴细胞增殖活性的影响结果见表2。从表2可以看出，黄芩水提取物能显著地抑制由ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞的增殖活性，相应浓度的抑制率结果见图1。 表1中药对小鼠正常脾淋巴细胞增殖活性的影响（略） 与对照组比较，各受试药组实验结果经统计学处理，P＞0.05；n=3 3.3中药对小鼠LPS诱导的脾淋巴细胞增殖活性的影响结果见表3。从表3可以看出，黄芩水提取物能显著性地抑制由LPS诱导的小鼠脾淋巴细胞的增殖作用，且具有浓度依赖性，即随着药物浓度的增加，其抑制率也增加，结果见图1。其IC50为19.00μg/ml。5 表2中药对小鼠ConA诱导的脾淋巴细胞增殖活性的影响（略） 与对照组比较，△△P＜0.01 药物浓度C/μg・ml-1 图1黄芩水提取物对ConA及LPS诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖的抑制作用（略） 表3中药对小鼠LPS诱导的脾淋巴细胞增殖活性的影响（略） 与对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；n=3 3.4中药对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响结果见表4及图2。 表4中药对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响（略） 与对照组比较，△△P＜0.01；n=3 从表4和图2可以看出，蒺藜和罗布麻水提取物能够显著性地增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能，并随着药物浓度的增加，其相应的吞噬功能也随之增强。 图2蒺藜及罗布麻水提取物增加小鼠巨噬细胞吞噬功能（略） 4讨论 淋巴细胞在机体的免疫调节中起核心作用。巨噬细胞是巨噬能力强，容量最大的细胞，其在免疫系统中也同样起着重要的作用［9］。淋巴细胞增殖作用以及巨噬细胞的吞噬功能常用于评价药物对细胞免疫功能的影响。本实验选用ConA及LPS诱导淋巴细胞增殖以及巨噬细胞的吞噬功能，研究中药对机体的免疫调节作用。黄芩为唇形科植物黄芩的根，具有清热、泻火、解毒、免疫调节等作用。2000年，贺海平等［6］报道，从黄芩中分离的类黄酮，显著性抑制PHA诱导的淋巴细胞的增殖，在2.5×10-45 mol/L浓度时，其抑制率可达89%~99%。本实验采用XTT比色法检测小鼠脾淋巴细胞增殖作用。XTT法为检验浮游细胞的增殖活性的特异方法，其原理为检测细胞内酶的生物活性，具有敏感性高的特点。通过该检测法检测的结果表明，黄芩对正常小鼠脾淋巴细胞的增殖作用无明显影响，但对ConA及LPS诱导的脾淋巴细胞增殖活性具有显著的抑制作用。T，B淋巴细胞膜表面分别存在ConA和LPS受体，当ConA和LPS分别作用于相应受体时，导致T，B细胞进入细胞周期进行有丝分裂增殖反应淋巴细胞进入增殖周期后的整个过程都是以DNA合成复制为中心，因而DNA复制过程中的任意环节的破坏都会导致整个细胞增殖周期的中断，使细胞代谢活性降低，因此可推断黄芩对小鼠脾淋巴细胞的增殖的抑制作用可能是抑制了细胞周期中DNA复制过程中某一环节。鉴于黄芩对小鼠脾淋巴细胞显著的抑制作用，我们将通过体外实验，从免疫抑制作用及细胞毒等方面，进一步对黄芩的抑制机理进行研究，并拟在红斑狼疮、溃疡性结肠炎、类风湿性关节炎等自身免疫性疾病的动物模型中加以应用，观察其药效学效果，为开发治疗自身免疫性疾病的药物奠定基础。蒺藜、罗布麻使巨噬细胞对中性红的吞噬功能增强，表明药物增加了巨噬细胞的免疫反应，提高机体免疫力，其吞噬功能作用机理及增强免疫机能机理有待进一步研究。 参考文献： ［1］李磷,丁安伟,盂丽.女贞子多糖的免疫调节作用研究［J］.中药药理与临床,2001,17(2)：11. ［2］盖玲,盖云,宋纯清，等.吴茱萸对大鼠佐剂性关节炎的治疗作用［J］.中成药，2001,23(11)：808. ［3］罗瑞芝,贾伟,赵利斌，等.何首乌研究进展［J］.中草药,2005,36(7)：1097. ［4］HwanSuckChunga,MoonkyuKanga,ChongwoonChoa,SeongkyuParkb,HongyeoulKimc,YooSikYoond,JaehoonKange,MinKyuShine,MooChangHonge,HyunsuBaee.Inhibitionoflipopolysaccharideandinterferon-gamma-inducedexpressionofinduciblenitricoxidesynthaseandtumornecrosisfactor-alphabyLithospermiradixinmouseperitonealmacrophages［J］.JournalofEthnopharmacology,2005：412. ［5］李新建,刘晓城.姜黄素调节小鼠免疫功能的实验研究［J］.中国组织化学与细胞化学杂志,2005,1(14):133. ［6］贺海平,秦篝,陈明.黄芩类黄酮对人免疫细胞化学发光及淋巴细胞增殖的影响［J］.中国免疫学杂志,2000,16（2）：84. ［7］RoehmNW,RodgersGH,HatfieldSM,GlasebrookAL.AnimprovedcolorimetricassayforcellproliferationandviabilityutilizingthetetrazoliumsaltXTT［J］.lmmunolMethods,1991,142(2)：257. ［8］郑志,林玲.神经细胞的培养理论与实践,第1版［M］.北京：科学出版社,2002：194. ［9］周丽娟,许利平.中药抗炎免疫药理免疫调节研究进展［J］.ChineseJournalofBasicMedicineintraditionalChineseMedicine,2004,10(7)：79.5
