微生物标准操作规程三

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1、XXX人民医院检验科微生物室标准操作文件文件编号：JY-WSW-SOP-007版本号：2007第1次修改编写者：XXXXXX审核者：XXX修订日期：2012年1月15日页码：第1页共2页深部真菌检验标准操作规程1．概述深部真菌包括念珠菌属、新型隐球菌、丝孢酵母属、曲霉属等。通过对分离的病原菌鉴定及抗真菌药物的敏感性等，协助临床诊断、治疗、流行病学调查研究和院内感染的监测。2．标本类型痰、气管抽吸物、支气管肺灌洗吸出液、支气管刷子、气管内管、肺穿刺或活组织、尿、粪、脓、各种体液、尿道及阴道分泌物、咽拭、脑

2、脊液、血等。3．检验流程3.1分离培养3.1.1粪、痰等可用无菌棉签或接种针挑取带血、黏液的病理性部分，支气管保护性毛刷标本悬液、肺泡灌洗液、尿等液体标本可以无菌吸管吸取离心沉淀物接种于含氯霉素的沙氏葡萄糖琼脂及科玛嘉念珠菌显色培养基，分别置37℃培养48小时。3.1.2脑脊液吸取离心沉淀物0.5ml，接种2管沙氏葡萄糖琼脂斜面，分别置25℃及37℃培养1周(部分新型隐球菌菌株在37℃不生长)。3.1.3血标本量为培养基量的1/10，以无菌操作注人脑心浸出液肉汤血培养瓶，充分混合后立即送检，不可放冰箱暂

3、存。37℃5～7日出现混浊或菌团，涂片镜检同时移种沙氏葡萄糖琼脂斜面或念珠菌显色培养基。3.2鉴定与结果报告3.2I如未见菌落生长，可报告“无真菌生长”。3.2.2常见的酵母菌在科玛嘉念珠菌显色培养基即可报告。白念珠菌：绿色，翠绿色；热带念珠菌：蓝灰色，铁蓝色；克柔念珠菌：粉红色(模糊，有微毛，菌落较大)；光滑念珠菌：紫色。3.2.3如为不显色的酵母菌，分纯后作APl20CAUX或自动微生物鉴定仪鉴定。如怀疑是新型隐球菌，可接种于七叶苷琼脂或咖啡酸琼脂，新型隐球菌在24～72小时后菌落变为黑或褐色（+）

4、，其他隐球菌或酵母菌不变色(一)。3.2.4如为霉菌，应种于察氏琼脂，其为鉴定青霉、曲霉及镰刀霉的标准培养基，根据菌落形态、色素及镜下结构(具有属特征的帚状枝、分生孢子头及特征性的大型分生孢子)鉴别这三个属。其他丝状真菌可作小培养，根据其结构作出菌种鉴定。3.2.5出现下面情况需要再孵育24～48小时：可见丝状菌生长，因菌落过小尚无法鉴定。在真菌直接镜检中观察到菌丝或较多的孢子，而48小时后未见菌落生长。如出现大量的细菌污染影响菌落的鉴定，应及时分离移种。326传统的鉴定白念珠菌方法血清芽管试验：待检菌

5、接种于0.5ml血清中混匀，37℃2小时后观察有无芽管形成。有芽管形成者98％为白念珠菌。每批血清使用前应接种白念珠菌标准株作阳性对照。米粉吐温小培养：将无菌载玻片放人无菌平皿(9cm规格)，溶解培养基后倒在玻片上，待固后划线接种待检菌株，旁边放一湿棉球保湿，盖上平皿，25～28℃48小时后取出小培养，加盖玻片后置显微镜下观察。白念珠菌可见顶端厚壁孢子。4．临床意义4.1目前临床上分离出的酵母70％～80％为白念珠菌及光滑念珠菌，其他在念珠菌显色培养基不能鉴定的酵母，可做APl20CAUX鉴定至种。无菌

6、部位采集的标本(如血、脑脊液、胸腹水、关节液等)中分离的任何酵母都必须鉴定到种，均有诊断意义。同一部位反复分离出同一菌种也具重要意义。4.2从非无菌部位(粪、痰、咽拭等)分离到的条件致病菌(如白念珠菌)，如直接镜检阳性，须认定具致病性。光滑念珠菌因以前归类于球拟酵母属，故只能见到小的孢子，无念珠菌属具有的假菌丝及菌丝。5．注意事项5.1所有的标本必须在生物安全柜中操作。5.2痰标本切勿冷藏。5.3尿液标本中不得加入防腐剂及消毒剂，否则会影响阳性检出率。5.4标本应在病人使用抗真菌药前采取。6．生物安全防

7、护参见《二级生物安全管理程序》。7．鉴定流程酵母纯培养米粉吐温琼脂培养基有假菌丝形成无假菌丝形成有顶端厚壁孢子–白念珠菌无顶端厚壁孢子尿素酶试验有关节孢子无关节孢子，但有芽孢阳性阴性无芽孢–地霉属有芽孢–丝孢念珠菌属菌落无红色菌落呈红色咖啡酸试验红酵母属无棕色色素–隐球菌属有棕色色素–新型隐球菌球拟酵母属参考文献临床微生物检验标准化操作（第二版）。