少腹逐瘀汤对气虚血瘀模型大鼠红细胞膜组分的影响研究

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1、少腹逐瘀汤对气虚血瘀模型大鼠红细胞膜组分的影响研究　　少腹逐瘀汤亦出自王清任《医林改错》，王氏治疗血瘀常用桃仁、红花、赤芍、当归、川芎等辛温或辛而微温之品。以温为主少用药性偏凉的活血祛瘀药物，体现王氏治疗瘀血偏于温散的特点，这与中医认为血属阴，得温则行，得寒则凝的思想有关。少腹逐瘀汤中药物配伍亦是如此。方中诸药相伍，温经活血，散寒止痛，以治疗寒凝气滞，瘀血结于少腹胞宫之诸证。　　对于血瘀证研究而言，虽然有关中医宏观辨证和西医微观辨证的冲突方面的争论一直存在，但不可否认的是作为目前中西医研究衔接较好的证候，有关血瘀证在血液流变学、微循环、血液动力学方面的异常已得到

2、公认。因此，以气虚血瘀大鼠模型，从血液流变学及红细胞膜组分变化探讨少腹逐瘀汤改善气虚血瘀的作用机制，为血瘀证相应方药药理作用及作用机制的研究提供更为客观的依据。　　材料　　1.动物清洁级雄性Wistar老龄大鼠40只，雌雄各半，体质量（27519）g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供[动物合格证号SCXK（黑）2008004]。　　2.药物少腹逐瘀汤由当归9g，赤芍6g，川芎6g，延胡索3g，蒲黄9g，干姜3g，肉桂3g，小茴香，没药3g，五灵脂6g组成，上述十味药，加10倍量水浸泡，加热回流煎煮2次，第1次，第2次，合并煎煮液，浓缩成浓度为/kg的少腹逐瘀汤

3、备用。　　3.仪器Anthos2010酶标仪（郑州博赛生物工程有限责任公司），BECKMAN低温超速离心机（美国贝克曼库尔特有限公司），LBY-N6B型血液黏度仪（北京普利生仪器有限公司），LBY-BX型红细胞变形仪（北京普利生仪器有限公司），TGL-16G型高速台式离心机（上海医用分析仪器厂），Waters2695高效液相色谱仪（美国Waters公司），蒸发光散射检测器ELSD2000（美国Alltech公司），LBY-XC全自动动态血沉测试仪（北京普利生仪器有限公司）。　　4.试剂巯基（南京建成生物工程研究所，批号20120503）；唾液酸（由南京建成生物工

4、程研究所，批号20120503）；丙二醛（malonaldehyde,MDA）（南京建成生物工程研究所，批号20120423）；Na+-K+-ATP酶（南京建成生物工程研究所，批号20120428）。　　方法　　1.分组及给药40只大鼠按体质量随机分为4组，即少腹逐瘀汤高剂量组（生药/kg）、少腹逐瘀汤低剂量组（生药/kg）、模型组（蒸馏水）和空白组（蒸馏水）。其中除空白组给予正常饮食饮水外，正式造模前1d禁食不禁水，之后每天置于水深（301）cm，水温（402）℃水槽中，力竭游泳。当大鼠出现自然下沉（头没入水面超过5s）为终止信号，将大鼠取出烘干。每天力竭游泳

5、后再给正常饮食量的1/3饲养，每天每只大鼠按照40g/kg喂食，每日1次，连续14d。末次造模后禁食不禁水12h。　　2.红细胞膜的制备取新鲜肝素抗凝血2mL以及枸橼酸钠抗凝血6mL。其中枸橼酸钠抗凝血以3000r/min离心10min，弃上清液，除去中间的白细胞和血小板层，再以1∶3比例加入等渗pH值PBS，3000r/min离心10min，弃上清液，反复洗涤3次，最终得到干净的红细胞。按照1∶80比例向红细胞中加入预冷的5mmol/LpH值Tris-HCl溶液，同时加入/L蛋白酶抑制剂PMSF（对甲苯磺酰氟），超声15min（80Hz，20℃），放入4℃冰箱

6、过夜使其充分溶血。红细胞溶血液以15000r/min离心10min，弃上清液，加入5mmol/LpH值Tris-HCl溶液以15000r/min离心10min，反复洗涤3次，最后得到乳白色膜，将其1∶1悬浮在PBS溶液中，膜蛋白定量后置于低温冰箱备用。　　3.血液流变学指标检测　　全血黏度的测定：取肝素抗凝血1mL，用LBY-N6B型血液黏度仪测定全血黏度。　　血浆黏度的测定：取肝素抗凝血1mL离心（3000r/min，10min），取血浆用于血浆黏度测定。　　红细胞变形性的测定：取肝素抗凝血20L，加入15%PVP悬浮液1mL中混匀，吸取500L采用LBY-B

7、X型红细胞变形仪进行测定，剪切参数分别为600、800、1000s-1。　　4.红细胞膜组分变化　　红细胞膜胆固醇含量测定取制备好的红细胞膜液，加入提取液（氯仿∶甲醇=2∶1），向膜液中每加入涡旋振荡器剧烈振荡混匀，直至全部加完后，避光室温静置2h，取下层有机层2mL，作为供试品溶液。　　红细胞膜Na+-K+-ATP酶活性测定采用比色法测定红细胞膜上Na+-K+-ATP酶活性。　　红细胞膜唾液酸及巯基含量测定根据试剂盒说明书检测红细胞膜上唾液酸及巯基含量。　　红细胞膜MDA水平检测根据试剂盒说明书检测红细胞膜上MDA水平。　　5.统计学方法采用SPSS软件处理所

8、得数据，选用One-wa