2-蜘蛛酶-发表论文集

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1、蜘蛛酶（Arazyme）论文集《饲料与畜牧》2009，5：46-48饲用金属蛋白酶的研究和应用（一）张泽虎，关静姝，王达（北京金英赛得科技有限公司）1引言蛋白水解酶(protease)可分为内肽酶(endopeptidase)和外肽酶(exopeptidase)两大类。内肽酶根据其活性基团类型一般可分为5类，即：丝氨酸蛋白酶(EC3.4.21)、半胱氨酸蛋白酶(EC3.4.22)、天门冬氨酸蛋白酶(EC3.4.23)、苏氨酸蛋白酶(EC3.4.25)和金属蛋白酶(EC3.4.24)[1]。在自然界中，金属蛋白酶主要存在于动物体内或由微生物分泌，伍久

2、林等[2]（2008）从鲤鱼（Cyprinuscarpio）肌肉中分离纯化到一种金属蛋白酶，史劲松等[3]（2006）报道冰川耐冷菌（BacilluscereusSYP-A2-3）可分泌冷适性金属蛋白酶。目前的研究表明，金属蛋白酶除了对蛋白质具有比较强的分解能力外，还对温度、pH值以及高金属离子浓度环境具有较强的耐受力[2-4]。因此，金属蛋白酶作为饲料添加剂在养殖动物上应用具有很大的优势。但由于目前在该领域金属蛋白酶的研究报道并不多，因此，笔者将结合源自蜘蛛肠道内共生微生物HY-3所分泌的金属蛋白酶——蜘蛛酶（Arazyme®），对此类酶制剂的特

3、性进行介绍。2金属蛋白酶的定义及特性2.1金属蛋白酶（Metalloprotease）的定义活性中心中含有金属离子的蛋白水解酶的总称。在这类酶中，金属离子被氨基酸残基紧密地结合在一起，构成活性中心，这个金属离子对于酶活性是很重要的。对于不同的金属蛋白酶，其包含的金属离子也有所不同，主要是Ca2+和Zn2+。一些金属蛋白酶以及所包含的金属离子见表1。表1金属蛋白酶及所包含的金属离子金属蛋白酶所包含的金属离子羧肽酶AZn2+羧肽酶BZn2+胶原酶Ca2+、Zn2+热溶素Zn2+蜘蛛酶Zn2+2.2金属蛋白酶的特性2.2.1金属蛋白酶的催化机制依赖于含金

4、属离子的活化中心金属蛋白酶主要是一类Zn2+依赖性的蛋白水解酶，其活性中心除金属离子外，还需要其他氨基酸残基参与。未活化的金属蛋白酶在前肽上有半胱氨酸通过配位键与Zn2+相连，激活时此键打开，其活化方式有以下几种途径：（1）氨基酸残基被金属离子、疏基试剂或氧化剂作用或修饰；（2）受促溶剂（KI）和去垢剂（SDS）作用而引起多肽改变；（3）被丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶裂解，失去一小分子肽段；（4）自身激活[5]。图1显示的是金属离子（Zn2+、Fe2+、Mn2+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Co2+）对蜘蛛酶相对酶活性的影响，其中Zn2+对蜘蛛酶活性的

5、影响最大，在5mMZn2+时蜘蛛酶的相对活性是无Zn2+存在时的4倍，而其他的几种金属离子也都不同程度的激活了蜘蛛酶的活性；虽然当Cu2+的浓度达到10mM100蜘蛛酶（Arazyme）论文集时，蜘蛛酶相对酶活出现下降，但是也维持在原酶活性（100%）。图1金属离子对蜘蛛酶相对酶活性的影响由于饲料中含有矿物质添加剂，通常情况下仔猪日粮中铜和锌的需要量为6mg/kg和100mg/kg（NRC,1998），但是作为高铜使用时，铜的含量会达到125-250mg/kg[8]，仔猪断奶后前两周配合饲料中氧化锌形式的锌允许添加量≤3000mg/kg（中华人民共

6、和国农业行业标准NY-929-2005），因此，饲用酶制剂是否能够耐受金属离子是评价其能否在饲料中添加使用的重要指标之一。2.2.2金属蛋白酶的抑制剂表2几种主要的蛋白酶抑制剂对蜘蛛酶活性的影响抑制剂浓度保留酶活（%）金属蛋白酶抑制剂EDTA(mM)1042邻二氮杂菲(mM)20胃蛋白酶抑制剂（uM）1.5100丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF（uM）50081碘乙酰胺（uM）10072半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64（uM）5.691TLCK（uM）50100TPCK（uM）50100卡托普利（uM）182金属蛋白酶含有定量的金属离子，用一般方法是不能将其

7、除去的。但是如果加入EDTA等抑制剂，就会使其因失去金属离子从而失去酶活性，只有再将这种离子加入才能恢复酶活性。表2显示的是几种主要的蛋白酶抑制剂对蜘蛛酶活性的影响，其中2mM邻二氮杂菲完全抑制了蜘蛛酶的活性，10mMEDTA抑制了58%的酶活性，而其它几种抑制剂的抑制作用不明显[4]。2.2.3温度对金属蛋白酶活性的影响温度是影响酶促反应速率的重要因素之一，不同来源的金属蛋白酶对温度的耐受能力也是不同的。从鲤鱼肌肉中纯化得到的金属蛋白酶活性温度范围为30-50℃[2]；来源于草鱼肌肉的金属蛋白酶最适温度为40℃[6]；而来源于微生物的金属蛋白酶其

8、对温度的耐受性更强，国内学者发现冰川耐冷菌（BacilluscereusSYP-A2-3，简称BCP）分泌的金属蛋白酶最适