单核细胞、中性粒细胞分离方法及注意事项

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1、单核细胞分离方法将用等体积生理盐水稀释的抗凝血，加入塑料离心管中的FicollHypaque分离液表面，以450g离心25min收集单个核细胞，用10小牛血清的RPMI一1640培养液悬浮细胞，置于6x6cm玻璃培养皿中，在5％CO2、37℃下孵育2h，收集贴壁的单核细胞。用0.2乳白蛋白的RPMI-1640培养液悬浮单核细胞，Wright染色计数单核细胞>95％，调整细胞密度为4×10／ml。将细胞悬液加入24孔培养板中，在5％CO2，37℃下培养24h，离心收集上清液，冻存于一70℃冰箱中备用。细胞培养前后台盼蓝染色法测定细胞存活率。细胞分离中需要注意的几个问题1.如果您

2、要做细胞培养，记住实验中所用的试剂（分离液，洗涤液等）、器械等都要是无菌消毒的，并注意实验中的无菌操作。2.离心转速单位及时间：目前国外的文献报道基本上用g为单位，注意g和转速（rpm）的换算。3.离心温度：有的要求室温，有的要求4摄氏度。实验的操作要求尽可能熟练，连贯。4.在用Ficoll分离单个核细胞（PBMC）时，通常含有少量的红细胞，对于一般的实验影响不大，如果实验要求较高，可采取裂解液（有的需要无菌），并注意裂解时间控制，以免影响单个核细胞的活性。5.在用Percoll配不连续梯度时（一般用高渗NaCl），注意各成份体积的准确性，否则密度与预期的不一样，影响分离效果

3、。6.用全血离心效果比全血稀释后再离心效果差，稀释一般等体积稀释一倍。7.分离液与样本的体积比：一般应小于1：2（即一般为1体积分离液，2体积样本，不宜超过2体积，小于2体积均可）8.洗涤液的成分：不同文献报道不一，有的使用PBS，有的为Hank’s，KRP等，可自己选定。主要是离子浓度及成份的不同，有的含有Mg2+,Ca2+。9.细胞活性：0.2%台盼蓝染色3－5分钟，镜下观察计数死亡细胞（蓝染）。中性粒细胞分离的方法1、标准方法：Ficoll-泛影钠（Ficoll-Hypaque）密度梯度及红细胞裂解法1）取一50ml聚乙烯管，无菌采集人外周静脉血，加4.4ml3.8%或

4、5%的柠檬酸盐液定容至40ml。上述全血300gX20min，离心，室温。2）吸出富含血小板的上清，2500gX15min，制备无血小板血浆（platelet-poorPlasma,PPP）。3）余下的沉降全血加入5ml　6%Dextran(分子量500,000，用无菌生理盐水配制)，并用生理盐水（0.9%）调节最终体积至50ml，轻轻、彻底混匀。室温沉降30min。4）吸出富含白细胞的上层液，275gX6min。5）沉淀的细胞用8mlPPP-生理盐水（1：4）重悬，并移到15ml离心管中。6）悬液细胞上面加入3mlFicoll-Hypaque（密度1.077），750gX5

5、min，室温。7）吸取富含中性粒细胞和红细胞层，用0.155M　NH4Cl重悬细胞，使红细胞裂解，然后中性粒细胞用含0.25%BSAHanks平衡液（HBSA，无钙）洗2次，最终用HBSA（含钙）重悬。8）用此法可得95%以上的中性粒细胞。2、不连续的密度梯度血浆－Percoll离心法1）先制备Percoll储存液：Percoll原液（100%）:0.9%NaCl的体积比为9：1。2）取一50ml聚乙烯管，无菌采集人外周静脉血，加4.4ml3.8%或5%的柠檬酸盐液定容至40ml。上述全血300gX20min，离心，室温。3）吸出富含血小板的上清，2500gX15min，制备

6、无血小板血浆（platelet-poorPlasma,PPP）。4）余下的沉降全血加入5ml　6%Dextran(分子量500,000，用无菌生理盐水配制)，并用生理盐水（0.9%）调节最终体积至50ml，轻轻、彻底混匀。室温沉降30min。5）吸出富含白细胞的上层液，275gX6min。6）沉淀的细胞用2~3mlPPP重悬7）在一15ml离心管中依次加入2ml42%、2ml51%Percoll(均为用PPP新鲜配制)、2~3ml细胞悬液，275gX10min.8）单个核细胞及部分血小板位于血浆与42%Percoll液之间，中性粒细胞位于42%Percoll与51%Perco

7、ll之间。血小板可通过25%Percoll离心5min去除，也可在原密度梯度中加入第三个25%Percoll一起离心去除。9）中性粒细胞层用PPP液冼1次，再用含糖的Krebs-Ringer磷酸缓冲液（KRPD，PH7.23）洗1次。10）用这种方法可得80%中性粒细胞，纯度在95%以上。