2012《医学细胞生物学》设计型实验

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1、设计型实验设计报告实验项目：动物细胞融合细胞核的分离与鉴定小组成员：班级：-9-医学细胞生物学设计型实验设计报告姓名班级学号评分实验项目：动物细胞融合实验原理：细胞融合，即在自然条件下或人工方法（生物的、物理的、化学的），是两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的过程。有性繁殖时发生的精、卵细胞结合是正常的细胞融合。诱导融合的方法很的，常用的主要有生物法（灭活的仙台病毒）、化学法（聚乙二醇）、物理法（电泳）。灭活的仙台病毒的磷脂外衣与动物细胞的膜十分相似，且病毒外壳上的某些糖蛋白可能还有促进细胞融合的功能。PEG是一种去垢剂，能破坏互相的接

2、触的磷脂双分子层，从而是相互接触的细胞膜之间的融合，形成一个双核或多核的细胞。目前用得最广泛的是聚乙二醇，因为它易得、简便、且融合效果稳定。实验步骤：（1）50%PEG夜的制备称取一定量的PEG（Mv=4000）放入烧杯中，沸水浴加热，使之溶化，待冷却至0℃时，加入等体积预热至50℃的无血清1640液混匀，置于37℃中保温备用。（3）大白鼠细胞的制备左手抓老鼠，将大白鼠头部向下，右手持尖头镊子轻轻插入眼眶中，然后将眼球向外拉出。①-9-将流出的血置于事先盛有Alever溶液的烧杯中制成1：4的悬液。②取1ml的悬液加入4ml的生理盐水，混

3、匀平稳之后，800r/min离心3min,弃去上清液，再按上述条件离心2次。③最后弃去上清液加hanks液4ml离心1次，再弃去上清液后，将离心管倒置于滤纸上，尽量流尽剩余液体（液体残余会改变PEG浓度）（4）诱导与温育用手指轻弹离心管底壁，是沉淀物松散，然后吸取50%的PEG0.5ml,在37摄氏度水浴中，缓慢逐滴加入离心管中（90s以内），边加边摇动离心管，使之与细胞混合均匀，然后加入8-10ml左右hanks液轻轻吹打（防止融合的细胞分开）混匀，放入37℃水浴箱中静置5min（以稀释PEG），之后离心弃去上清液，加hanks液5ml

4、离心1次，弃上清液，之后加入含小牛血清的1640培养液，在37℃的水浴中培养30分钟。（5）染色观察分别于温浴5min、10min、20min、30min的时段取细胞悬液一滴制成临时装片，以0.2%次甲基兰染液染色三分钟后，盖上盖玻片，放在显微镜下进行观察。实验结果分为五个阶段：1、两个细胞的细胞膜之间相互接触粘连2、相接触的两细胞膜破口粘合。形成细胞膜通道3、两细胞之间的细胞质相通，形成细胞质通道4、通道扩大，两细胞连成一体5、细胞核并完成，形成一个含有两个或多个核的圆形细胞均能在不同时间的临时装片上看到-9-预期结果：在显微镜下可看见

5、有2个或2个以上的大白鼠细胞膜融合在一起，形成1个异核体细胞。细胞融合率的计算：融合率是指在显微镜的视野内，已发生融合的细胞，其细胞核的总数与此视野内所有细胞的细胞核总数之比。通常用百分数来表示，且进行多个视野测定，求平均值，在统计较为准确。计算公式：融合率=×100%注意事项：1、pH为8.0-8.2是影响细胞融合与否的关键因素之一2、制备50%PEG保温在37-39℃水浴中，不然冷却后晶体析出，且细胞融合对温度很敏感。3、为观察细胞融合的形态需对细胞进行染色除詹姆斯绿外还可用HE染色。4、在离心管中加入PEG前，一定要将离心管倒置于滤

6、纸上，流尽剩余液体，否则残留液会改变PEG液的浓度。5、PEG的处理时间:处理时间越长，融合效果越好,但对细胞的毒害也就越大。故一般将处理时间限制在1分钟之内。教师：日期：-9-实验仪器、设备、器具表实验项目：动物细胞融合表1—1实验仪器表名称规格、型号数量说明显微镜1观察尖头镊子1夹取、染色等水浴箱1恒温处理离心机1离心载玻片/盖玻片4制作装片10ml离心试管10装待离心液10ml量筒2量取试剂大烧杯1盛装废弃液体实验项目：动物细胞融合表1—2实验材料和试剂表名称规格用量说明大鼠1聚乙二醇Mv=4000诱导剂hanks液缓冲液，等渗液0

7、.2%次甲基兰染液染色剂RPNI1640培养液10%灭活小牛血清和无血清两种营养液Alever溶液抗凝暂时保持细胞完整-9-医学细胞生物学设计型实验设计报告姓名班级学号评分实验项目：细胞核的分离与鉴定实验原理：细胞核：它是由核膜（nuclearmembrane）、核骨架（nuclearscaffold）、核仁(nucleolus)几部分组成。细胞核的主要构造为核膜，是一种将细胞核完全包覆的双层膜，可使膜内物质与细胞质、以及具有细胞骨架功能的网状结构核纤层分隔开来，其上特殊物质可被染色剂染色显现出颜色。核体的制备:核体是指含有少量细胞质并由

8、质膜包裹的细胞核。分离细胞核的可用方法有吸出法、原生质体破裂法、差速离心法排和排除法。差速离心法是根据细胞内各种细胞结构的比重和大小不同，因而在同一离心场内的沉降速率不同从而将细胞内的结构分级