镉重金属对野生稻与栽培稻杂交选育后代种子萌发

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1、前言实验设计的思路是参照《水稻_OryzasativaL__省略_的重金属毒害与耐性的分子机理研究_葛才林》博士论文的研究框架与结果，如下图所示。实验选择测定的物质有：糖类代谢：淀粉酶活性与同工酶测定、苹果酸脱氢酶、细胞色素氧化同工酶分析、甘露聚糖酶、蔗糖酶活性检测。蛋白质代谢：谷胱甘肽含量测定、蛋白酶活性测定、镉诱导蛋白合成分析。脂类代谢：丙二醛测定、酯酶测定分析、脂氧合酶同工酶分析。抗氧酶检测：POD过氧化物酶、SOD超氧物歧化酶、同工酶检测。1515《镉重金属对野生稻与栽培稻杂交选育后代种子萌发、幼苗形态建立的生理影响研究实验设计》从基础物

2、质代谢（糖类代谢、蛋白代谢、脂类代谢）、抗氧化机制两大方面进行实验设计。一、基础物质代谢1、糖类代谢（1）水稻主要储藏物质代谢：淀粉淀粉酶活性与同工酶测定【1】【实验结果文献参考】实验设计：淀粉酶活性的测定 一、原理 淀粉酶能将淀粉水解成麦芽糖，由于麦芽糖能将3，5-二硝基水杨酸试剂还原成3-氨基-5-硝基水杨酸的橙红色化合物，且在一定范围内还原糖的浓度与反应液的颜色成正比，故利用比色法可求出麦芽糖的含量。以5分钟内每克样品水解产生麦芽糖的毫克数表示酶活性的大小。 植物淀粉酶可分为α-淀粉酶和β-淀粉酶两种，其中β-淀粉酶不耐热，在温度70℃以上

3、易钝化：而α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下则发生钝化。根据以上特性，可分别测定这两种淀粉酶的活性。如测定α-淀粉酶和β-淀粉酶的活性，即为淀粉酶总活性。 15二、实验材料、仪器及试剂 1．仪器： 20ml具塞试管移液管100ml容量瓶石英砂研钵 721型分光光度计离心机恒温水箱离心管 2．试剂： （1）1%淀粉溶液：称1.0克可溶性淀粉，加入100ml蒸馏水煮沸。（临用时配制） （2）pH5.6柠檬酸缓冲液：A、称取柠檬酸21.0克，溶解后定容至1000ml；B、称取柠檬酸钠29.4克，溶解后定容至1000ml；量取A液55ml与B液145ml

4、混匀，即为pH5.6的缓冲液。 （3）0.4mol/L氢氧化钠溶液。 （4）3,5-二硝基水杨酸试剂：取1.0克3,5-二硝基水杨酸，溶于20mlmol/L氢氧化钠中，加入50ml蒸馏水，再加入30克酒石酸钾钠，待溶解后，用蒸馏水稀释至100ml，盖紧瓶盖，勿使二氧化碳进入。 （5）麦芽糖标准溶液：称取0.1000克麦芽糖，溶于少量蒸馏水中，然后定容至100ml，取为1mg/ml麦芽糖标准液。实验材料：萌发水稻种子。 三、实验方法 1．酶液的制备：称取去根萌发水稻种子2克（含外壳），置研钵中，加1克石英沙研磨成匀浆。用8ml蒸馏水分次洗涤研钵，将

5、匀浆转入离心管中，搅拌均匀后放置15～20分钟（间隔搅拌2～3次）。3500rpm离心10分钟，将上清液转入100ml容量瓶，用蒸馏水定容至刻度，得粗酶液。 2．α淀粉酶与β-淀粉酶的酶促反应： 取4支10ml具塞刻度试管，编号，按下表加入各液： 15 将以上各管混匀后，置40℃水浴准确保温5分钟，取出后立即向3、4号试管中加入4ml0.4mol/LNaOH终止酶活性。 3．麦芽糖的测定： （1）标准曲线制作：取20ml刻度试管7支，编号，分别加入1mg/ml麦芽糖标准液0，0.2，0.6，1.0，1.4，1.8，2.0ml，然后各管加蒸馏水，使

6、体积均达2ml，再向各管加3，5-二硝基水杨酸试剂2ml，置沸水浴中煮沸5分钟，取出后冷却，用蒸馏水稀释至20ml，摇匀后在520nm波长下用分光光度计比色，以光密度值为纵坐标，麦芽糖含量为横坐标绘制标准曲线。 （2）样品的测定：取以上酶作用后的反应液及对照管中的溶液各2ml，分别放入20ml具塞刻度试管中，加入2ml3，5-二硝基水杨酸试剂，置沸水浴中准确煮沸5分钟，取出冷却，用蒸馏水稀释至20ml，摇匀在520nm波长下用分光光度计比色，记录OD值，从麦芽糖曲线中查出相应麦芽糖含量，进行结果计算。 四、结果计算  15A—为酶反应管中麦芽糖含

7、量，即3，4号管中麦芽糖毫克数的平均值。 A′—为对照管中麦芽糖含量，即1，2号管中麦芽糖毫克数的平均值。参考《现代植物生理学实验指南》淀粉酶同工酶检测【2】（2）呼吸中的糖相关代谢：苹果酸脱氢酶15（2）细胞色素氧化同工酶分析（4）其他糖代谢检测：*参考《现代植物生理学实验指南》#甘露聚糖酶（参考《植物激素对水稻种子萌发过程中_甘露聚糖酶活性的调控_任艳芳》152、蛋白质代谢（1）谷胱甘肽含量测定15（2）蛋白酶活性测定参考《现代植物生理学实验指南》1999p149(3）镉诱导蛋白合成分析3、脂类代谢（1）脂膜氧化：丙二醛测定*实验方法参考《现

8、代植物生理实验指南》1999p305(2)酯酶测定分析：参考《现代植物生理实验指南》15#脂氧合酶同工酶（参考水稻种子成熟和萌发过程中脂