内参即是内部参照

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1、内参即是内部参照，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测基因的表达水平变化时常用它来做参照物。常用的PCR内参有GAPDH、β-actin、18sRNA、28sRNA、B2M、ACTB、SDHA、HPRT1、ARBP内参基因等正向引物（上游引物）是沿着负链进行不间断延长的　　反向引物（下游引物）是沿着正链进行一段段延长的　　正链是含有目的基因的那条链。　RT-PCR为反转录RCR（reversetranscriptionPCR）和实时PCR（realtimePCR）共同的缩写。逆转录PCR，或者称反转录PCR(reversetranscription-PCR,RT-PCR)

2、，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。　由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶H降解，留下互补DNA。　RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA。RT-PCR广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量。（检测基因表达的方法，参见Nort

3、hernBlot法。RT-PCR的关键步骤是在RNA的反转录，要求RNA模版为完整的且不含DNA、蛋白质等杂质。常用的反转录酶有两种，即鸟类成髓细胞性白细胞病毒（avianmyeloblastosisvirus,AMV）反转录酶和莫罗尼鼠类白血病病毒（moloneymurineleukemiavrius,MMLV）反转录酶。RT-PCR有时候也会指代实时PCR(real-timePCR)。为了与逆转录PCR相区别，通常被写作“定量PCR”(quantitativePCR)或者RTQ-PCR(real-timequantitativePCR)。3实时PCR　　实时PCR(real

4、-timePCR)，属于定量PCR（Q-PCR）的一种，以一定时间内DNA的增幅量为基础进行DNA的定量分析。realtimePCR的定量使用荧光色素，目前有二种方法。一种是在dsDNA中插入特异的荧光色素，例如SYBRGreen荧光染料；另一种使用一种能与增幅DNA序列中特定寡核酸序列相结合的一种荧光探针（probe），如Taqman探针。两种方法原理不同。SYBRGreen荧光染料游离时不发光，当反应体系中存在双链DNA时，SYBRGreen与双链DNA结合，此时才发光。Taqman探针带有一个荧光基团和一个淬灭基团，荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭基团则在3’末端。P

5、CR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，此时荧光基团发出的荧光信号可以被检测到。　　realtimePCR与reversetranscriptionPCR相结合，能用微量的RNA来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。这两种RTPCR的组合又被称之为“定量RT-PCR（quantitativeRT-PCR）”RT-PCR技术相关试剂1oligo:多聚体，相当于mRNA引物2AMVRT：禽类成髓细胞瘤病毒逆转录酶

6、3MMLVRT：莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶4dNTPs：脱氧核苷酸5RNase：RNA水解酶6PCRBuffer：RT-PCR缓冲液7MgCl2：2价镁离子PCR各步骤的目的5.1预变性　　破坏DNA中可能存在的较难破坏的二级结构。使DNA充分变性，减少DNA复杂结构对扩增的影响，以利于引物更好的和模板结合，特别是对于基因组来源的DNA模板，最好不要吝啬这个步骤。此外，在一些使用热启动Taq酶的反应中，还可激活Taq酶，从而使PCR反应得以顺利进行。5.2三种循环8模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之

7、成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；9模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；10引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。5.3延伸时间原因11用PCR仪扩增时,(变性.退火,延伸)循环完成后,继续72度延伸了10分钟的原因：12延伸时间取决于待扩增DNA片段的长度。