elisa实验方法合集

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1、第-1-页（共44页）1.ELISA[酶联免疫吸附试验]原理与分类——12.酶联免疫吸附技术（ELISA）的操作要点——43.蛋白质分析技术(WesternBlot、ELISA、免疫荧光与免疫组化技术)——84.细胞ELISA操作步骤（ENGLISH）——145.如何正确的进行ELISA测定操作——156.ELISA法测定单克隆抗体的效价——197.免疫组化基本原理——208.免疫组化技术优点——209.免疫组化实验步骤——2110.免疫组化技术之免疫荧光法——2311.免疫组化技术之免疫酶法——

2、2412.免疫组化技术之免疫金银法——2613.免疫组化操作要点及技巧——2714.免疫组化技术的关键问题——2815.免疫组化染色注意事项——3016.免疫组织化学工作流程——3317.免疫细胞化学常用试剂－封固剂——3318.免疫细胞化学常用试剂－酶消化液——3419.免疫细胞化学常用试剂-其它——3520.ELISA试验中所用物品及试剂详解——3721.ELISA常用试剂的配置——43第-2-页（共44页）ELISA[酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验]原理与分

3、类原理与分类原理与分类原理与分类基本原理基本原理基本原理基本原理1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检

4、标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。方法类型和操作步骤方法类型和操作步骤方法类型和操作步骤方法类型和操作步骤ELISA可用

5、于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：（1）固相的抗菌素原或抗体，即"免疫吸附剂"（immunosorbent）；（2）酶标记的抗原或抗体，称为"结合物"（conjugate）；（3）酶反应的底物。根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。用于临床检验的ELISA主要有以下几种类型：2.2.1双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法双抗体夹心法双抗体夹心法双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操

6、作步骤如下：1）将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。2）加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。3）加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。4）加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色，测知标本中抗原的量。在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等

7、。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。如抗体的来源为抗血清，包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性，而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应，作一步检测。在一步法测定中，当标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成"夹心复合物"。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象，此时反应后显色的吸光值（位

8、于抗原过剩带上）与标准曲线（位于抗体过剩带上）某一抗原浓度的吸光值相同（参见1.3.2，图1-4），如按常法测读，所得结果将低于实际的含量，这种现象被称为钩状效应（hookeffect），因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重时，反应甚至可不显色而出现假阴性结果。因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）时，应注意可测范围的最高值。用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的