水系霍乱弧菌监测点技术规范

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1、附件2：水系霍乱弧菌监测点监测技术规范一、采样与送检技术规范1、水体：水体的采样一般要求用灭菌的500ml水样瓶采集相对静止的表层水（30cm以内）500ml，加盖密封后在室温（20—25℃）下送实验室检测。取水点的选择应结合流行病学调查等资料确定，同时，采样时应选择在水流平稳或静止处吸取。非疫情状态下的监测采样时间一般在清晨时，此时水体未受人群活动等因素影响。每个采样点中采样位置应相距数米、采集不少于2瓶作为平行检测。采样时立即测定采集样品的温度、PH，并记录当天的最高温度和最低温度，数据始终随每份样品的检测报告逐级上报。2、水

2、产品：水生动物的采样通常选取活的新鲜的水生动物为采集对象，有时也应考虑冰冻的水生动物，以无菌操作采集合适的部位，如腮部和/或肠内容物等，置采样瓶（管）或食品采样袋密封，在常温下送检。有条件的采样点可将水生动物整体采回实验室在进行相关处置。同时，要求以无菌棉签涂抹五只（条）以上的某类水生动物体表、腮及/或肛门，置碱性蛋白胨水送检，每管碱性蛋白胨水作一份样品看待。3、样品的送检：统一要求在样品采集后，按生物安全规范，在室温条件下3小时内送递实验室开展霍乱弧菌的分离培养。在北方地区冬季采样时，应注意样品的保温，防治结冰。二、水体和水产品

3、样本霍乱弧菌分离培养技术规范（一）培养基要求：以碱性蛋白胨水（ph8.6）作为增菌液；强选择性分离培养基使用庆大霉素培养基或TCBS培养基；弱选择性培养基统一使用碱性琼脂。每批培养基在使用前必须进行质量检测。（二）水体样本的增菌：增菌培养方法规定采样一下两种之一。1、十倍浓缩碱胨水增菌培养法:详见《霍乱防治手册》（第五版）第75页。2、滤膜富集增菌培养法：以0.45微米滤膜，使用Millipore真空过滤系统进行细菌富集，富集后的滤膜置含有终浓度为1/20万亚硒酸钾的10ml碱性蛋白胨三角瓶内增菌。3、水产品样品增菌：使用无菌棉签

4、涂抹的样品，直接接种到碱性蛋白胨水作为增菌液处理。整体或局部采回的样品，在实验室应先在无菌操作的条件下，将其解刨，取腮部和肠内容物剪碎后，置100ml三角瓶内，加入5—10倍体积的碱性蛋白胨水增菌；但小贝壳类动物，则用锤子将外壳击碎，整体放入三角瓶中增菌；甲壳类动物除含肉质部分外，其余部分部分（包括腮、肠、足、表层外壳等）整体放入三角瓶进行增菌处理。4、环境样品的霍乱弧菌分离培养程序：样品在37℃经8—12h增菌后，每份样品分别接种一个9cm直径的庆大霉素琼脂或TCBS琼脂平板和一个碱性琼脂平板进行划线分离培养，同时，以无菌吸管吸

5、取0.2—0.5ml增菌液接种到新的碱性蛋白胨水中，进行二次增菌培养后，再如上述步骤进行划线分离培养。特别强调所有环境样品的增菌分离培养步骤必须包括上述二次增菌和强、弱双平板分离。5、疑似菌落鉴定基本要求：分别从庆大霉素琼脂或TCBS琼脂、碱性琼脂平板上各挑取5个以上的（少于5个的全部挑取）疑似菌落接种于营养琼脂斜面置37℃18—24h纯培养（即每份样品至少从4个分离平板上获得约20株可疑菌落菌株），取斜面纯培养物进行O1群及O139群霍乱诊断血清玻片凝集试验，血清凝集阳性的菌株继续相关的系统鉴定并报告结果。必须注意同一样品中O1

6、、O139群霍乱弧菌可能同时存在，有必要对所有选出的菌株都进行凝集试验，以免遗漏。从环境中检出的O1或O139群霍乱弧菌，要求即时上送省疾病预防控制中心进行噬菌体—生物分型，具备条件的进行毒素基因的PCR检测、确定是否采取相关措施。在有条件的单位，对血清凝集试验阴性的菌株，可进行氧化酶和粘丝试验初筛O1/非O139群霍乱弧菌，并保留菌株按监测方案的要求逐级上送至省疾病预防控制中心。