芥子油苷测定方法

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1、高效液相色谱对芥子油苷的提取和分离I准备阶段：1.水浴锅设置80℃2.配制两瓶70%的甲醇，其中一瓶置于水浴锅中温浴。3.5mM苄基芥子油苷.2.33mg/ml4.0.5M醋酸盐（PH=5）[30mlHAC，960mlH2O，加10-20gNaOH粉末，调至PH=5]5.20mM的醋酸盐，PH=5：将4中的稀释25倍6.DEAEsephadexA-25：称取3g树脂，加90ml0.5M醋酸盐（PH=5）室温过夜溶解。7.硫酸酯酶：15mg溶解于6ml20mM醋酸钠中，PH=5（16100uM/hour/g）II芥子油提取1.取新鲜莲座叶，鲜重5-10mg2.放入1.5mlEP管中，迅速放入液氮

2、。3.研磨成粉末后并加入1ml预热的70%的甲醇。4.加入50ul5mM的苄基芥子油苷5.盖好盖子漩涡震荡置于冰上，剩下的样品重复步骤3-4。6.所有的样品置于80℃10min。7.4000rpm，10min。8.将上清液转移至1.5的离心管。9.用预热的甲醇重新提取两次，收集所有的上清液至4ml，-20℃保存。III芥子油苷的脱硫纯化1.搅拌DEAEsephadexA-25树脂成溶液，用1ml的移液器取1ml加入BioRad管中，让其沉淀。2.用5ml的灭菌水清洗（禁止干燥）。3.加入所有的芥子油苷提取液。4.用2ml的70%的甲醇清洗两次，2ml的灭菌水清洗5次，2ml20mM醋酸盐PH=

3、5清洗一次。5.加入0.5ml硫酸酯酶，直至上侧的橡胶管中剩余1-2mm的液相。IV脱硫芥子油苷的洗脱1.用1ml灭菌水洗脱3次。2.浓缩至EP管中剩余0.5ml液体VHPLC分离脱硫芥子油苷1.取60ul洗脱液于HPLC管中，吸入30ul2.检测：PDA190nm-370nm（或者DV229nm和260nm）3.流速：1ml/min4.运行梯度：灭菌水（A）和甲醇（B），60minA100%,B0%2minAto60%B线性48min，60%Bto100%B线性3minA0%，B100%3minBto100%A线性4minVI芥子油苷的HPLC-MS5.取60ul洗脱液加入HPLC管中，吸入

4、6ul6.检测：质谱，[M+Na+]7.流速：0.25ml/min8.运行梯度：混有50uM的醋酸钠灭菌水（A）与甲醇（B），60minA100%,B0%2minAto60%B线性40min，60%Bto100%B线性5minA0%，B100%5minBto100%A线性8min