rnai 在干细胞研究中的应用及其进展

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1、RNAi在干细胞研究中的应用及其进展摘要   在各类生物中，双链RNA（dsRNA）诱导产生特异性基因沉默的机制，被称为RNA干扰（RNAi）。dsRNA干扰技术可通过降解靶基因的mRNA进行基因干涉，是研究多种生物基因功能的有效手段。本文从RNAi相关的Dicer、Agronaute基因家族等来认识其基因沉默必需基因与干细胞功能特性的关系，并综述利用RNAi干扰技术在干细胞研究与应用的进展。关键词RNAi干细胞增殖分化DicerAgronaute   几十年来，一直认为RNA仅仅从DNA获取遗

2、传信息，并将信息转换成蛋白质。但最近研究发现，小RNA(smallRNA)发挥着基因调控的作用。小RNA能关闭基因的表达，或改变基因表达的水平。在发育过程中通过关闭或开放基因的表达，小RNA可能指导着细胞的定向分化并决定细胞的命运[1]。九十年代初期研究发现21到28个核苷酸的小RNA能抑制植物的基因表达，随后在动物细胞中也发现了这一现象。但直到1998年2月华盛顿卡耐基研究院的Fire和马萨诸塞大学癌症中心的Mello首次将双链RNA（dsRNA）注入线虫，结果发现诱导了比单独注射正义链或者反

3、义链都要强的基因靶向专一性的基因表达沉默（genesilencing）。他们将这种现象称为RNA干扰（RNAinterference,简称RNAi）。随后许多研究者先后采用不同长度的dsRNA使线虫、果蝇、植物、动物卵细胞和哺乳类细胞等的靶向基因表达明显降低或沉默，因此人们把这种利用dsRNA使目的基因敲低或使目的基因沉默，从而研究目的基因的功能即为RNA干扰技术（RNAi技术。RNA干扰技术由于其独特优点在干细胞研究中备受关注和应用。本文主要综述RNA干扰技术在干细胞研究中的应用及其进展。一、

4、RNAi的机制及其必需基因1、1RNAi的机制   实验表明：RNAi反应中，加入的dsRNA被切割为21-23nt小片段RNA即siRNA，后者会使目的mRNA被切割为21-23nt的siRNA。Hammond等人部分纯化了一种RNaseⅢ型酶（如Dicer等），该核酸酶具有序列特异性，它仅降解与引起RNAi的dsRNA具有同源序列的mRNA。当dsRNA导入细胞后，被一种dsRNA特异的RNaseⅢ型酶Dicer识别,切割成21-23nt的siRNA，这些片段可与该核酸酶的dsRNA结合结构

5、域结合，并且作为模板识别目的mRNA；识别之后，mRNA与dsRNA的有义链发生链互换，原先dsRNA中的有义链被mRNA代替，从酶-dsRNA复合物中释放出来，而mRNA则处于原先的有义链的位置。核酸酶在同样位置对mRNA进行切割，这样又产生了21-23nt的siRNA,与Dicer形成复合物即RNA诱导基因表达沉默复合物（RISC），继而RISC特异性地对目的mRNA进行切割，从而使目的基因沉默，产生RNAi现象。就目前的研究知道在各种生物均存在通过不同长度的dsRNA引起基因表达沉默的RN

6、Ai现象。如哺乳动物细胞无论RNA干扰活动,它们都有降解长片段dsRNA产生21-22nt的siRNA的能力。Tuschl研究则进一步说明甚至在几种更长片段dsRNA不能产生RNAi的哺乳动物细胞中，siRNA依然能够引起基因表达沉默。而在哺乳动物细胞长片段dsRNA不能产生RNAi的原因可能是长于30nt的dsRNA掩敝RNAi的IFN反应的非特异性激活。但Billy研究提示在鼠未分化的EC细胞和ES细胞通过长片段dsRNA诱导RNAi引起特异基因表达沉默。同时Yang的研究显示鼠ES细胞通过

7、siRNA诱导RNAi引起相应目的基因沉默。但通过长片段dsRNA和siRNA引起基因沉默的程度目前仍不清楚。1、2RNAi的必需基因   通过遗传分析的方法，目前已从线虫中分离到RDE-2，RDE-3和Mut-7等、果蝇中的ago2等、拟南芥中的sgs-2、sgs-3、argonaute1(ago1)、sde1、sde3、caf、ddm-1、met-1等RNAi相关的基因。研究发现这些基因多数属于多基因家族，有很大的保守性。进一步研究发现，许多基因沉默必需蛋白与一些基因表达调控因子结构相似,如

8、拟南芥的DDMI蛋白与染色体再构因子SW12/SNF2相似；拟南芥的MET1是一种维持DNA甲基化转移酶；线虫的RDE-1与翻译因子Eif2C结构相似。这可能表明，基因沉默机制在生物的进化中有很大的保守性和多样性。二、RNAi在细胞分裂或分化中的作用   通过改变染色体的形状（更紧或更松），能够决定某一个基因表达。近来研究揭示参与RNAi的siRNA在染色体形状的改变时起着非常重要的作用。这样RNAi能永久的关闭基因的表达，而不仅仅是短期的抑制它。而我们知道染色体中心粒周围的异染色质控制着细胞的