NY336-1998增产菌筛选方法.pdf

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1、NY336--1998前言本标准由农业部科学技术与质量标准司提出并归口。本标准起草单位:中国农业大学。木标准卞要叔草人:梅汝鸿、徐维敏、蒋慧敏。中华人民共和国农业行业标准NY336-1998增产菌筛选方法Screeningmethodsforyield-increasingbacteria1范围本标准规定1'芽抱杆菌(Bacillussp.)增产菌的筛选技术指标、筛选方法。本标准适用于芽抱杆菌增产菌新菌株的筛选。2引用标准「列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修汀，使用本标准的各

2、方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。HG/T3309-1993农药粉剂细度测定方法(原HG/T2-896-83)NY337--1998增产菌使用方法3总则增产菌属芽抱杆菌是依据植物微生态学原理研制出的一种微生态制剂。增产菌采用了从植物体内分离内生共生芽泡杆菌菌株的筛选方法，经过菌株纯化、生物测定、菌株鉴定、复壮促活，筛选出的菌株通过两年两点田间试验和多点试验，选择能够稳定提高植物产量、改进品质、增强抗逆性，并且经安全性测定，对人、畜及植物无毒、无害，对环境无污染的菌株，供生产使用。4主要方法提要与技术指标4.1方法提要4.1.1收集样本植株或各部

3、位的组织冲洗24h，严格进行表面消毒，然后捣碎制成悬浮液，沉淀。4.1.2取上清液经划线或稀释后在牛肉汁平板培养基上培养24h,4门.3选取有代表性的单菌落进行涂片、染色和镜检，选取芽泡杆菌的单菌落移到斜面培养基上编号、培养，进行生物测定.4.1.4分别进行室内生物测定，选择生物测定较佳纯菌株再进行田间试验。4.1.5选择通过两年田间试验或多点试验表现增产、防病等效果好的菌株，并经安全性检查对人、畜及植物无毒，对环境无污染的菌株，才可提供生产使用。4.2技术指标4.2.1采集的样本植株要在80C水浴锅内加热处理10.20min,以杀死杂菌。4.2.

4、2分离得到的芽抱杆菌菌株，应在28--35℃温度下培养1824h，此为芽抱杆菌最适宜生长的环境4.2.3将待生物测定的作物，包括种子、植株或块(根)茎，置于含芽抱杆菌浓度有101悬浮液中浸泡1ho-.~一~-一一，一一一一-一一一一一一一一一种-一一一一，一一一~一.-一一-中华人民共和国农业部1998一06一11批准1999一01一01实施NY336-19985筛选方法5.1样本的采集5.1.1直接采样方法取样时应注意以下三点:a)徉本植株应与所选的增产菌施用作物相一致;b)要选择在产量、品质或各种抗逆性方面比同类植株有明显优势的植株;c)选好样

5、品植株后，进行编号、登记，立即分离或置于4C条件下保存。5门.2间接采样方法如采取样本植株有困难，可选采集不同地区的土壤.在室内种植作物，按5.1.1规定的原则采集样本植株5，2菌种分离5.2.1仪器设备和试剂仪器设备:无菌操作室或超净工作台、灭菌锅、水浴箱、冰箱、温箱、灭菌研钵和研棒、灭菌管(5mL,10MI)、磁力振荡器、灭菌平皿、灭菌试管、无菌水、酒精灯、接种环、显微镜、玻片、灭菌玻璃球。试剂,pH试纸、氢氧化钠、盐酸、漂白粉、品红、孔雀绿和香柏油等。5-2-2培养基制备5.2.2.1试剂牛肉.A.(生化试剂)、蛋白陈(生化试验)、琼脂(生化

6、试剂)5.2-2-2培养基材料牛肉膏3g,蛋白陈10g,氯化钠，琼脂2030g,蒸馏水1000ml-,5.2-2.3培养基制法将琼脂加热化开，加牛肉汁和蛋白陈，再加热溶解，用。ilmol/L的盐酸或0.1mol/L氢氧化钠溶液调pH值至7,0-7.5，分装三角瓶或试管置灭菌锅内，在。1MPa压力下灭菌30min，冷却后制成斜面培养基备用5.2.3分离培养5.2-3.1分离取5.1.1和5.1.2的样本植株的根、茎、叶、花和果实、种子或块茎(根)组织冲洗24h，严格进行表面消毒，然后取组织log剪碎，放入装有40mL无菌水和10粒无菌玻璃球的三角瓶中

7、，在200-300转振荡10min(如分离表皮以内的细菌，则先经0.5%的漂白粉液表面消毒3-5min，用无菌研钵研碎后，再振荡，静置0.5min，用灭菌吸管取5mL上清液注人灭菌试管内备用)5.2.32培养将5.2-3.1处理的盛有上清液的试管置于80℃的水浴锅内恒温处理20min。然后用灭菌移种环蘸取试管内处理液，在牛肉膏蛋白陈培养基平板上划线划线方法:先在培养皿平板的半边顺序划线，再将培养皿转90,，将移种环灭菌后从第二条线处开始顺序划线(或用L型或△型无菌涂棒，将菌液均匀地涂布在平板表面，必要时采用稀释平板法或单菌落)，置28-35C下培养

8、24h后再观察5.2.13菌落挑选根据细菌在平板培养基上形成菌落的形态，如菌落大小、形状、圆或不规则形，边缘毛状，菌苔厚或