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1、一、培养基的配制与灭菌技术 培养基是将微生物生长繁殖所需要的各种营养物质，用人工的方法配制而成的用于培养微生物的营养基质。培养基种类很多，不同的微生物所需培养基不同。就培养基中营养物质的来源可分为天然培养基、合成培养基和半合成培养基。按培养基特殊用途可分加富培养基，选择培养基、鉴别培养基。按培养基制成后的物理状态可分为固体培养基，液体培养基和半固体培养基。固体培养基是在液体培养基中加入1.5%-2.0%琼脂作凝固剂;半固体培养基则加入0.5%-0.8%的琼脂。 一般培养基除含有大量水分外,还含有碳素、氮素、无机盐类和维生素等。此外,由于徽生物生长繁殖必须在最适的酸碱度范围
2、内,才能表现出最大的生命活力,因此应根据不同种类的徽生物.将培养基调节到一定的pH值范围。 培养基配制后还必须进行灭菌,灭菌是指杀死或消灭所有微生物,包括营养体、孢子和芽孢。灭菌的方法很多，可分为物理方法与化学方法两大类。物理方法包括湿热灭菌、干热灭菌、紫外线灭菌、过滤除菌等;化学方法主要是利用化学药品对接种室空间、用具和其它物体表面进行灭菌与消毒。消毒一般是指消灭有害微生物的营养体和病原菌。(一)培养基的配制方法一般培养基的配制方法如下(各种天然培养基的配制方法略有不同)：l.按照配方的组分及用量先分别称量并配成液体；2.根据要求调到一定的酸碱度(pH值)；3.若要制成固体则加入
3、2%琼脂并加热融化；4.根据需要的数量分装入试管或三角瓶中,加上棉塞或盖上纱布；5.包扎好灭菌后备用。配制斜面培养基的一般操作步骤为：称量→溶解→调pH值→加琼脂→过滤→分装→加棉塞→包扎→灭菌→摆斜面→无菌检查。(图9-7)(二)培养基及常用器皿的灭菌 培养微生物常用的玻璃器具主要有试管、三角瓶、培养皿、吸管等,在使用前必须先进行灭菌,使容器中不含任何杂菌；培养微生物用的营养基质(培养基),在接入纯种前也必须先行灭菌,使培养基呈无菌状态。培养基可分装入器皿中一起灭菌,也可在单独灭菌后以无菌操作分装入无菌的器皿中。 1.棉塞制作与器皿包扎 为了避免玻璃器皿在灭菌后再受空气中
4、杂菌的污染,仍然能保持无菌状态,在灭菌前需进行严格的包装或包扎。试管和三角瓶常采用合适的棉花塞封口(也可采用金属、塑料及硅胶帽套),棉塞起过滤作用，只能让空气透过,而空气中的微生物则不能通过。制作棉塞应采用普通未脱脂的棉花（医用脱脂棉会吸水，不宜采用）,其制作方法有几种，可自行灵活掌握。制好的棉塞要求紧贴玻璃壁，没有皱纹和缝隙；总长度约为管口直径的2倍，插入部分约为2/3,松紧度合适；外露部分的粗细及结实程度，应合乎一定要求。 若因棉花纤维过短，可在棉塞外面包上1层纱布，便于无菌操作，减少棉塞的污染机率，并可延长棉塞使用时间。新做的棉塞弹性较大，不易定形,但插在容器上经过一次高
5、压蒸汽灭菌后，形状大小即可固定。三角瓶也可用8～12层纱布代替棉塞,通气效果更佳。 蒸汽灭菌前,一般将7-10支试管用绳扎在一起，用牛皮纸包裹棉花塞部分，再用绳扎紧；每个三角瓶可单独用牛皮纸包扎棉花塞部分,防止水蒸汽弄湿。培养皿是专为防止空气中杂菌的污染而设计的,底皿加上皿盖为一套。洗净烘干后通常每10套叠在一起，用牛皮纸卷成一筒，外面用绳子捆扎以防散开，然后进行灭菌。到使用时，才在超净工作台中取出打开。 洗净烘干的吸管，在吸气的一端用镊子或针塞入少许未脱脂棉花(棉花勿外露)，以防止菌体误吸入洗耳球中，或洗耳球中的微生物通过吸管而进入培养物中造成污染。每支吸管用一条宽约5
6、cm的纸条，以约45度角螺旋形卷起来，剩余一端折叠打结。灭菌后烘干，使用时才在超净工作台中从纸条抽出。 2.培养基与器皿的高压蒸汽灭菌 一般培养基、无菌水、耐热药物及玻璃器皿等常采用高压蒸汽灭菌法。该法的优点是时间短,灭菌效果好。它可以杀灭所有的微生物,包括最耐热的细菌芽孢及其它休眠体。 一般培养基常用0.1MPa(1kg/cm2或15Ib/in2),约120℃维持15-20分钟,便可达到彻底灭菌的目的；单独玻璃器皿灭菌的温度可高些,维持的时间可长些。灭菌的温度及维持的时间,应随灭菌物品的性质和容量多少而灵活掌握。要注意灭菌的因素是高温而不是高压,故灭菌锅内的冷空气要彻
7、底排除(在排除冷空气的条件下,蒸汽压与温度之间有一定关系)，否则,压力虽达到0.1Mpa(lkg/cm2),但温度并没有达到要求。 实验室常用的有自控或非自控卧式高压蒸汽灭菌锅(大量灭菌物品时使用),也有手提式小型灭菌锅(见图3-12)。3.玻璃器皿的干热灭菌 常用玻璃器皿(培养皿、三角烧瓶、试管、吸管等)、金属器皿及其它干燥耐热物品,烘干后经适当包扎(勿装液体),可采用干热灭菌法。干热灭菌一般在电烘箱内利用干热空气灭菌。 该法比湿热灭菌法所
