hplc色谱柱选择与维护保养

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1、HPLC色谱柱选择与维护保养Sa安捷伦科技安捷伦HPLC色谱柱选择分离模式的选择样品溶于有机溶剂溶于水溶于四氢呋喃非离子化离子化溶于有机溶剂溶于水溶于正己烷溶于甲醇或甲醇/水或乙腈或乙腈/水用硅胶的正相模式用键合相的正相模式用键合相的反相模式用键合相的反相模式低分子凝胶渗透色谱用键合相的反相模式抑制电离反相键合相色谱离子对键合相的反相模式用硅胶的正相模式离子交换模式凝胶渗透色谱凝胶过滤色谱大孔填料的离子交换模式用大孔填料的反相模式分子量>2,000分子量<2,000反相分配色谱极性:固定相<流动相固定相-非极性流动相(甲,乙醇,乙腈,THF,二氯乙烷)-极性非极性物质后出

2、峰正相吸附色谱极性:固定相>流动相固定相-极性流动相(己烷,庚烷)-非极性极性物质后出峰正相色谱20%反相色谱80%正相&反相色谱硅胶基质-pH3~8Al2O3.nH2O-pH1~14聚合物基质-pH1~14高或低pH下,硅胶会溶解化学修饰困难孔结构复杂,孔径不均匀导致柱效不够高,有机溶剂可能导致聚合物基质溶涨而受损柱填料基质C-18柱---性能影响因素键合类型碳覆盖率封端化学性质物理性质硅胶纯度色谱柱尺寸颗粒形状粒径表面积孔径硅胶纯度•填料硅胶的纯度与残留金属离子浓度色谱柱尺寸•填料床的长度和内径颗粒形状•球型或不规则型粒径•平均颗粒直径,通常3-10µm表面积•颗粒外

3、表面和内部孔表面的总和,以m2/gram表示孔径•颗粒的孔或腔的平均尺寸,范围80-300Å色谱柱物理性质C-18柱---性能影响因素键合类型•单体键合-键合相分子与基体单点相连•聚合体键合-键合相分子与基体多点相连碳覆盖率•与基体物质相连的键合相的量封端•键合步骤之后,用短链将裸露的硅羟基键合后封闭起来色谱柱化学性质C-18柱---性能影响因素A类硅胶OriginalZORBAXSIL(1970s)由于带负电荷的残留硅羟基和酸性表面上金属含量高(硅羟基的pKa低),导致碱性化合物发生拖尾B类硅胶(高纯)ZORBAXRx-Sil(1987)由于金属含量低,硅羟基pKa高,

4、碱性化合物不发生拖尾ZorbaxRx-SIL:11种金属<35ppm(未检出其他杂质,<1ppm);99.995%纯度的二氧化硅C-18柱---性能影响因素ZORBAX®生产工艺硅胶+脲(pH=2)+甲醛CH2O孔径80A&300ADO2250oC粒径1.8µm3.5µm5.0µm7.0µm微球表面的略微融合专利技术增强了硅胶填料的耐流动相冲刷能力---Zorbax色谱柱使用寿命长的技术保障安捷伦拥有此项溶胶-凝胶填料专利技术StableBondEclipseXDBBonus-RPExtendZORBAXRx多孔硅胶微球色谱柱尺寸---对色谱分离的影响•短柱(15-100

5、mm)-运行时间短,柱压低•长柱(150-250mm)-分辨率高,运行时间长•窄径柱(2.1mm)-检测器灵敏度高•宽径柱(3-21.2mm)-载样量高C-18柱---性能影响因素颗粒形状---对色谱分离的影响当使用黏度较大的流动相50:50=MeOH:H2O时,球型颗粒可以降低柱压,延长色谱柱寿命C-18柱---性能影响因素球形不规则形粒径---对色谱分离的影响较小的颗粒柱效较高,但会引起柱压过高.3.5µm粒径的常用于分离复杂的多组份样品,而组份单一的样品多采用5µm的粒径1.8µm3.5µm5µm7µm10µm表面积---对色谱分离的影响高表面积对于多组份样品的分

6、离具有较强的保留能力,柱容量和分离度.表面积低的填料通常能迅速达到平衡状态,对于梯度淋洗尤为重要C-18柱---性能影响因素孔径---对色谱分离的影响大孔的填料颗粒可以延长溶质大分子在填料表面滞留的时间,达到充分分离,改善峰形样品MW4,000,选择80Å的孔径样品MW>4,000,选择300Å的孔径大孔径填料适用于大分子分析大孔径300Å全多孔色谱柱可用于分离蛋白质和多肽分子量虽小但hydrodynamicvolume(水动力学体积)较大的分子Poroshell色谱柱高流速下,高柱效分析大分子的蛋白质和多肽色谱柱填料孔径必须适合待测物分子自由进出填料孔,与孔内表面的键

7、合相进行分离分配300Å孔径可改善蛋白质和多肽峰形0.2000.020.040.060.080.100.120.140.160.18300SB-C18(300Å)SB-C18(80Å)PW1/2LeuEnkephalinM.W.=556AngiotensinII(血管紧张素II)M.W.=1046InsulinBM.W.=3,496CytCM.W.=12,327Rnase(核糖核酸酶)M.W.=13,684Lysozyme(溶菌酶)M.W.=13,900孔径,分子量对峰宽的影响(梯度分离)选择合适的填料孔径分析大分子可获得最佳