有氧胁迫与细胞凋亡对铜绿微囊藻毒素释放的影响

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1、有氧胁迫与细胞凋亡对铜绿微囊藻毒素释放的影响摘要：2005年在美国佛罗里达洲的多处淡水域发生空前繁盛的蓝藻水华现象，该水华是由铜绿微囊藻大量繁殖引起的。用ELISA的方法简单分析毒素含量，并通过PCR方法使用特殊的引物检测产微囊藻毒素基因mcyB，并与已有的该基因进行比较。实验发现毒素的含量与可探测的藻浓度相关性很低，但当铜绿微囊藻受到盐浓度、物理损伤、使用除草剂、以及紫外照射等条件影响下毒素水平提高了90%。在相同的外界条件下，受胁迫的实验组比相应的对照组产过氧化氢量高了三倍。微摩尔量的过氧化氢对与藻细胞的程序性死亡的影响通过蛋白酶检测的方

2、法来分析。关键词：蛋白酶细胞胁迫过氧化氢铜绿微囊藻微囊藻毒素细胞程序性死亡1前言近年来随着水体污染和富营养化程度的不断加剧,我国的滇池和太湖等地已连续发生了多起蓝藻水华.蓝藻水华能释放具有毒性的微囊藻毒素(microcystins,MCs)。美国佛罗里达洲普遍出现的大面积蓝藻水华现象在过去的20年里已经受到相当的关注。铜绿微囊藻一整套产毒素的基因，从而对水体环境造成有害的影响。水体中蓝藻所产生的多种肝毒素会直接导致鱼类，家畜，甚至人类的死亡。但有趣的是，并不是所有的微囊藻都会产生有毒物质。在不同的实验条件下，藻体产毒素的量也不同，至于为什么藻

3、毒素产量会发生变化还是未知的，利用分子探针的方法，将产毒素的相关基因与抗体相结合，来坚定产毒素藻种。尽管在低浓度藻液中检测到产毒素的相关基因以及低水平的细胞毒素，但是环境条件引起毒素释放依然不确定。之前并没有关于环境条件胁迫与铜绿微囊藻产毒素有联系的相关报道。在铜绿微囊藻藻细胞中，过氧化氢是在全日照条件下由光化反应所产生的普遍产物。但过氧化氢的生物产量能够反映叶绿体内部氧化还原作用的不平衡状态，并且能反映细胞受胁迫的状态，测定过氧化氢含量的方法采用荧光探针检测。关于蓝藻毒素研究以及自然环境对铜绿微囊藻产毒素的影响研究出其应对环境胁迫潜在的补救

4、途径和可溶性藻毒素向环境水体中释放。2材料与方法2.1微囊藻采集铜绿微囊藻样本采集自手蓝藻水华污染水体表面（盐浓度为0.2‰，温度为32.7℃）。样品采集后立刻进行实验分析。2.2DNA的提取与扩增完整的DNA基因组序列通过DNeasyPlantMiniKit试剂盒提取。用分光光度计测量其吸光率得提取的DNA纯度约为1to10μg/ml。PCR扩增时使用特定的产毒素基因mcyB引物设计，扩增过程使用体系为25μl。PCR循环参数为94℃2min,94℃10s运行35个循环;40℃20s,72℃1min,最后延伸72◦Cfor5min.将PCR

5、产物以10μg/ml在1.2％琼脂凝胶电泳，并在紫外下观察条带结果。2.3序列分析及编号McyB基因的序列扩增可同时使用mcyB基因引物扩增和BigDyeTerminatorv3.1技术。扩增后的序列与数据库中已有的序列对比，确定是否与已知序列具有高度的相似性。2.4毒素的检测检测和量化释放到水体中的微囊藻毒素使用的是EnvirologixMicrocystinTubeKit试剂盒。这种酶联免疫吸附试验能够检测四种微囊藻毒素变种，并用分光光度计在450纳米吸光度测量。可构建出微囊藻毒素LR的的标准曲线。本实验的各种胁迫条件如下所述。2.5细胞

6、胁迫的测量方法为了建立细胞胁迫和藻毒素释放之间的关系，将铜绿微囊藻细胞产生过氧化氢的量作为应激反应的直接关联。这种类型的试验被作为普遍采用的一种标志性检测高等植物和海洋藻类应激反应的标志。所产生的过氧化氢的量通过荧光探针进行检测。绿色荧光强度与细胞内活性氧水平成正比，在激发波长502nm发射波长530nm附近，使用荧光显微镜，激光共聚焦显微镜，荧光分光光度计荧光酶标仪，流式细胞仪等检测DCF荧光，从而测定细胞内活性氧水平。检测提高盐浓度对铜绿微囊藻细胞毒素释放的实验，将藻细胞转移到50ml的大口烧杯中，在室温培养5h，然后取样80μl进行毒素

7、分析。检测紫外辐射对铜绿微囊藻产毒素的影响，将藻样置于一定强度的日光照射下，同时用50ml的圆锥管置于冷水中旋转，以保证光照条件下温度不发生变化。在选定的时间点分别提取80μl进行毒素分析。百草枯是植物光合作用中阻断电子传递链中电子传递的一种非选择性接触性除草剂。在其作用下，电子会直接传递给分子氧形成强氧化剂。为检测除草剂对微囊藻毒素释放的影响，恒温培养5h后，取样液80μl进行毒素分析。为了检测声波损伤对铜绿微囊藻毒素释放的影响，将样品进行20千赫兹处理后，缓慢混匀，5h后，取样液80μl进行毒素分析。2.6通过氧化应激诱导细胞凋亡为研究氧

8、化应激与细胞调往的关系，含1.05×108个细胞的铜绿微囊藻培养在50ml含有一定量的H2O2的河水中，并检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶活性。细胞用H2O2和50单位的