微生物学检验基本技术

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1、第四章　微生物学检验基本技术随着现代医学及相关科学技术的发展，各学科相互交叉和渗透，医学微生物学检验技术已深入到细胞、分子和基因水平，许多新技术、新方法已在临床微生物实验室得到广泛应用。医学微生物学实验室的基本任务之一是利用微生物学检验技术，准确、快速检验和鉴定临床标本中的微生物，并对引起感染的微生物进行耐药性监测，为临床对感染性疾病诊断、治疗、流行病学调查及研究等提供科学依据。第一节　微生物形态学检查细菌形态学检查是细菌检验的重要方法之一，它是细菌分类和鉴定的基础，可根据其形态、结构和染色反应性等，为进一步鉴定提

2、供参考依据。一、显微镜检查由于细菌个体微小，肉眼不能看到，必须借助显微镜的放大才能看到。一般形态和结构可用光学显微镜观察，其内部的超微结构则需用电子显微镜才能看清楚。常用显微镜有如下几种。1．普通光学显微镜　　采用自然光或灯光为光源，其波长约为0.4μm。显微镜的分辨率为波长的二分之一，即0.2μm，而肉眼可见的最小形象为0.2mm。故用油（浸）镜放大1000倍，能将0.2μm的微粒放大成肉眼可见的0.2mm。普通光学显微镜可用于细菌、放线菌和真菌等的观察。2．暗视野显微镜常用于观察不染色微生物形态和运动。在普通显

3、微镜安装暗视野聚光器后，光线不能从中间直接透入，视野呈暗色，当标本接受从聚光器边缘斜射光后可发生散射，因此可在暗视野背景下观察到光亮的微生物如细菌或螺旋体等。3．相差显微镜相差显微镜利用相差板的光珊作用，改变直射光的光位相和振幅，将光相的差异转换为光强度差。在相差显微镜下，当光线透过不染色标本时，由于标本不同部位的密度不一致而引起光相的差异，可观察到微生物形态、内部结构和运动方式等。4．荧光显微镜荧光显微镜与普通光学显微镜基本相同，主要区别在于光源、滤光片和聚光器。目前大多数使用的是落射光装置，常用高压汞灯作为光源

4、，可发出紫外光或蓝紫光。滤光片有激发滤光片和吸收滤光片二种。用蓝光的荧光显微镜除可用一般明视野聚光器外，也可用暗视野聚光器，以加强荧光与背景的对比。本法适用于对荧光色素染色或与荧光抗体结合的细菌的检测或鉴定。5．电子显微镜用电子流作为光源，波长与可见光相比差几万倍，大大提高了分辨力，并用磁性电圈作为光学放大系统，放大倍数可达数万倍或几十万倍，常用于病毒颗粒和细菌超微结构的观察。二、不染色标本检查不染色标本一般可用于观察细菌形态、动力及运动情况。细菌未染色时无色透明，在显微镜下主要靠细菌的折光率与周围环境的不同来进行

5、观察。有鞭毛的细菌运动活泼，无鞭毛的细菌则呈不规则布朗运动。梅毒苍白密螺旋体、钩端螺旋体、弯曲杆菌等的活菌各有特征鲜明的形态和运动方式，具有诊断意义。常用的方法有压滴法、悬滴法和毛细管法等。1．悬滴法在洁净凹玻片的凹孔四周涂上凡士林，用接种环取一环菌悬液放在盖玻片中央，再将凹玻片的凹孔对准盖玻片中央的液滴并盖上，然后迅速翻转，轻压盖玻片，使其与凹孔边缘的凡士林粘紧封闭后置高倍镜下（或暗视野）观察。2．压滴法用接种环取一环菌悬液置于洁净玻片的中央，在菌悬液上轻轻盖上一盖玻片，注意避免产生气泡并防止菌悬液外溢，静止数秒

6、钟后置高倍镜下明视野（或暗视野）观察。3．毛细管法主要用于厌养菌动力的检查。通常选用60~70mm长。0.5~1.0mm孔径的毛细管虹吸厌养菌悬液后，用火焰将毛细管两端熔封。并用塑胶纸将毛细管固定在载玻片上，置高倍镜下暗视野观察。三、染色标本检查细菌标本经染色后，由于细菌与周围环境间在颜色上形成鲜明对比，故在普通光学显微镜下可清楚地观察到细菌的形态特征（如细菌的大小、形状、排列等）和某些特殊结构（如荚膜、鞭毛、芽孢等），并可根据染色反应性对细菌加以分类鉴定。（一）细菌染色的一般程序细菌染色的一般程序是：涂片（干燥）

7、—固定—染色（媒染）—（脱色）—（复染）。1．涂片制备血液、分泌物、排泄物、穿刺液和液体培养物，直接在载玻片上作薄膜涂片；尸检或感染动物组织，病变局部涂抹采样的棉拭子直接涂片。固体培养基上的菌落或菌苔的制片，先用接种环取一环生理盐水置载玻片中央，再用无菌接种环取少量的培养物在生理盐水中磨匀，涂布成1cm2大小的涂面，置室温下自然干燥或远火慢慢烘干。2．固定目的是杀死细菌，凝固细菌蛋白及结构，便于染色；促使细菌粘附在载玻片上，避免在水洗过程中被水冲掉；改变细菌对染料的通透性，有利于菌细胞内结构的染色。通常用火焰加热固

8、定，将已干燥的涂片在火焰中迅速通过3次，以手背皮肤接触玻片不烫为佳。3．染色根据检验目的不同，选择不同的染色方法进行染色。染色时滴加染液，以复盖标本为度。4．媒染凡能增强染料和被染物的亲和力，使染料固定于被染物及能引起细胞膜通透性改变的物质，称媒染剂。常用的有明矾、鞣酸、金属盐和碘等，也有用加热法促进着色。媒染剂可用于初染与复染之间，也可用于固定之后或含于固