纤维素质原料生产乙醇综述

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纤维素质原料生产乙醇综述陈康（江南大学生物工程学院，0203110201）摘要：随着石油的日益短缺，利用可再生资源生产生物乙醇，受到越来越多的关注。纤维素是地球上含量丰富的一种可再生资源，目前以其为原料经预处理、糖化、发酵等工艺得到的燃料酒精，相比汽油等传统能源，有经济、环保等优势，正在发展成为一种新型可再生能源。从木质纤维素原料、预处理技术、发酵工艺、酶解和发酵的菌种以及影响发酵的抑制物去除等方面对生产燃料酒精的关键技术进行综合评述。关键词：纤维素发酵燃料乙醇工艺SummaryofcellulosicfeedstockforethanolProductionChenKangAbstract:Withthegrowingshortageofoil,theuseofrenewableresourcestoproducebio-ethanolwasgotmoreandmoreattention.Celluloseisabundantoneartharenewableresourceasrawmaterialforitscurrentpretreatment,saccharificationandfermentationprocessresultingfuelalcohol,comparedtogasolineandothertraditionalenergysources,economic,environmentalandotheradvantages,isbeingdevelopedasAnewrenewableenergy.Thispapercarriesoutcomprehensivereviewforkeytechniquesforproducingfuelalcoholfromaspectsofrawmaterialsoflignocellulose，pretreatmenttechniques，fermentationtechnology，enzymolysis，strainsof fermentationandremovalofinhibitorsaffectingfermentation,etc.Keywords：cellulosic；fermentation；fuelalcohol；technology引言随着人们对环境问题认识的加深，以及对所面临能源危机现状的忧虑，清洁、可再生的新能源———生物乙醇，受到了越来越多的关注。以植物生物质为原料，生产生物乙醇已成为主要的研究方向，它满足了绿色环保、可持续发展的要求。植物生物质主要包括：木材、1/6农作物秸秆、林业加工废料和废弃纸品等。利用纤维素质原料生产生物乙醇具有以下优势：清洁环保，不污染环境；生产成本低；原料来源广，且可再生。我国生物质资源十分丰富，每年仅农作物秸秆就产生7亿多吨，如果50%的秸秆被利用生产纤维素乙醇产品，产生的油气当量相当于再造了一个大庆油田。《国家能源科技“十二五”规划》明确鼓励开发以木质纤维素生产乙醇、丁醇等生物燃料产业化的关键技术，实施替代燃料乙醇技术工程示范。到2015年，中国生物燃料乙醇利用量将达到400万t，然而，2011年我国燃料乙醇产量仅为193.76万t，主要原料为玉米、小麦、木薯、陈化水稻等原料，纤维素生物乙醇技术仍处于中试阶段。纤维素乙醇作为新一代生物质能源，受到了中粮、中石油及圣泉集团等一批中国企业的关注，在该技术领域投入了大量的人力物力，现正处于由应用基础研究、工程放大到大规模工业化的过程。木质纤维素 原料主要由纤维素、半纤维素和木质素构成，纤维素乙醇生产过程主要包括原料预处理、纤维素酶解发酵、乙醇精馏脱水及废醪液处理等生产单元，面临木质纤维素原料复杂、酶解发酵效率低、能耗物耗高、工艺废水处理困难等科学及工程化难题。近年来，随着纤维素乙醇关键技术及装备逐步实现突破，纤维素乙醇在生产成本及环境友好性方面逐步具有市场竞争力，其技术及产业化进程引起了各国的广泛关注。1纤维素的预处理1.1常规预处理方法木质纤维素糖化前预处理常规的物理方法主要有机械粉碎、蒸煮、膨胀等；化学方法包括酸处理、碱处理等；生物方法则是利用白腐菌、褐腐菌、软腐菌等微生物产生的一些酶来降解木质素和半纤维素。1.2新型处理办法近年来，国内外专家在常规方法上进行了探索、改良，研发出了一些新的预处理技术，介绍如下：1.2.1蒸汽爆破技术蒸汽爆破技术是当今应用范围最广的木质纤维素糖化前预处理技术。先将原料通200℃2/6~240℃的高压蒸汽处理，然后迅速减压，使纤维素爆裂，木质素和纤维素分离。爆破过程中产生的醋酸及其他有机酸可将半纤维素溶解，使纤维素暴露出来，增大了微纤维与酶的可及性。此外，瞬时爆破产生的压力可使样品破碎降解，增大了反应的可接触面积。RUIZE等用蒸汽爆破法处理葵花秆，在220℃的预处理温度条件下得到了60.6% 的最高葡萄糖产率。若使物料粉碎到同样的粒径尺寸，蒸汽爆破法需要的能量仅为机械粉碎法的30%，但蒸汽爆破法形成的降解物如呋喃、脂肪酸和芳香类化合物等对发酵和酶解有抑制作用1.2.2高能辐射高能射线辐射属于物理方法的一种。其能使纤维素聚合度下降，结构松散，从而提高解反应的可及度和纤维素的水解效率。现在最常见的辐照源为放射性同位素钴-60或铯-137。木质纤维素分子在高能射线的作用下被活化和激发，导致部分共价键断裂形成自由基，这些自由基又通过交联反应或链剪切反应进一步诱发纤维素糖化。与常规方法相比较，高能辐射处理具有操作简单、处理时间短、处理量大、不污染环境等特点。陈静萍等研究发现，在最佳处理剂量1000kGy~1500kGy的条件下，用60Co-γ射线辐照与纤维素酶协同处理稻草，纤维素转化率最高可达88.7%，可溶性还原糖得率为21.44%。1.2.3超临界流体技术超临界流体技术是利用温度及压力均高于临界点的流体来降解纤维素物质，其最主要的影响因子为温度和压力。流体达到临界状态时，溶剂化能力急剧增强，电离程度随之增大，打破了木质素的包裹作用，同时也降低了纤维素的聚合度，使纤维素可以很快地溶解在超临界溶剂中，并迅速分解成低聚糖最后转化成葡萄糖。1.2.4微波处理微波即频率在300MHz~300GHz 的电磁波。在快速变化的高频电磁场作用下，被加热介质中的水分子的极性取向会随着外电场的改变而变化。分子的高速运动使微波场的场能转化为介质内的热能，从而导致原材料温度升高，产生热化、膨化等一系列反应，破坏了纤维素分子间的氢键，提高了纤维素的可及度、反应能力和基质浓度，且处理时间短，操作方便。1.2.5超声波技术超声波是频率高于20000Hz的声波，其产生的巨大能量使木质纤维素受到振动而破碎，释放出可降解的多糖。超声波也可使液体流动而产生大量的微小气泡，微小气泡（空化核）在声场的作用下振动产生声压。当声压到达一定数值时，气泡急速增长，接着突然闭合产生冲击波，并产生上千个大气压力，破坏木质纤维素结构使其分散于液体中。LIMH等先用8g/LNaOH碱溶液对罗布麻（AV）纤维软化，之后用28kHz的低频超声波和53kHz高频超声波分别处理3h后发现，前者可使其表面10μm~50μm范围内的交联成分和表面混杂物被清除，后者可使其内部空腔纤维被消除。1.2.6有机溶剂法有机溶剂法是将木质纤维素原料用有机溶剂与无机酸催化剂的混合物处理，达到脱除半纤维素和木质素并分离出纤维素成分的目的。常见的有机溶剂有低沸点的甲醇、乙醇以及高沸点的丙酮、乙二醇和四氢化糠醇。此外，某些有机酸如草酸、水杨酸和邻醋酸基苯甲酸也能达到无机酸催化剂的效果。有机溶剂法处理木质纤维素原料后底物酶可及度和纤维素水解率都比较高。SUNFB等采用空气丙三醇自3/6动催化有机溶胶预处理方法来增加木质纤维素的酶水解能力。将木质纤维素原料在温度220℃、液固比为20∶1（g/g）的条件下处理3h， AAGAOP可使木质素降解65%，半纤维素降解70%。经电镜扫结构分析，AA-GAOP能够破坏其原纤维结构。作为一个全新的技术，AAGAOP通过改变木质纤维素的物理结构特征、清除化学结构障碍来加强酶水解能力，最终达到使木质纤维素降解的目的。1.2.7离子液体处理近年来，离子液体作为一种较为理想的纤维素反应介质和替代溶剂成为国内外纤维素研究领域的热点。离子液体是一种在室温或低温条件下由无机阴离子和有机阳离子相互结合而成的呈液态的盐类化合物。与一般有机溶剂相比较而言，离子液体具有难挥发，无毒性且无污染等优势。2002年美国权威期刊《美国化学会志》JACS（JournaloftheAmericanChemicalSociety）首次报道了1-丁基-3甲基咪唑氯盐（[C4MIM]Cl）能够很好地溶解天然纤维素，并能加工、制备各种天然的纤维素材料。2糖化纤维素是一种已聚糖，半纤维素主要是戊聚糖，糖化就是指纤维素和半纤维素水解成含几个单糖的低聚糖的过程。2.1酸水解法无机酸催化纤维素分解的机理是:酸在水中解离并产生H+，H+与水构成不稳定的水合氢离子。当纤维链上的β-1，4葡萄糖苷键和水合氢离子接触时，后者将一个H+交给β-1，4葡萄糖苷键上的氧，使得这个氧变成不稳定的4价氧，当氧键断裂时，与水反应生成2个羟基，并重新放出H+，溶液中游离H+浓度越高水解速度越快，故多采用强酸，又 可分为稀酸水解、浓酸水解。稀酸水解一般要求在高温高压条件下进行，能耗大，时间要求严格，时间过短原料水解不完全，时间过长会使单糖进一步降解成糠醛等化学物质，糠醛等降解物对后续微生物发酵有毒副作用，此时最好选用特定的菌种。2.2酶水解法产纤维素酶的微生物有真菌和细菌，典型的木霉纤维素酶是3种酶的混合物，包括葡聚糖内切酶(EG)、纤维二糖水解酶(CBH)和β-葡萄糖苷酶(BG)。首先，葡聚糖内切酶作用于微纤维的非结晶区，使其露出许多非还原性末端，随后葡聚糖外切酶从非还原性末端依次分解产生纤维二糖，随后部分降解的纤维素进一步由内切葡聚糖酶和葡聚糖外切酶协同作用，分解生成纤维二糖、三糖等低聚糖，最后由β-葡聚糖苷酶作用分解成葡萄糖。纤维素酶水解的限制步骤是葡聚糖内切酶对无定型纤维素的水解，产生新的非还原末端，进而实现葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶的作用。酶水解的最大优点是反应条件温和、能耗低、效率高、选择性强、三废少，缺点是速度慢、周期长。目前纤维素酶主要依赖真菌中的霉菌生产，活力仍很低，与淀粉酶相比通常要相差2个数量级以上，使纤维素的水解速率和效率都极其低下，生产成本过高，这也是酶法降解纤维素的技术瓶颈。获得纤维素酶高产、高活力菌株，优化酶组分组成，并在此基础上采用固定化酶等进一步提高酶的稳定性和使用寿命，是解决这一问题的根本所在。3发酵3.1菌株木质纤维素水解液中主要含有葡萄糖、木糖和L-阿拉伯糖，以及少量半乳糖、甘露糖4/6 和鼠李糖等。葡萄糖是大多数微生物可以利用的碳源，因此要提高木质纤维素类生物质转化为乙醇的效率，就要筛选出能够利用其他糖类发酵的菌株。目前菌株筛选的方法主要有从自然界中筛选、诱变育种、原生质体融合以及基因工程育种等。刘天霞从自然界中筛选出了156株能够发酵木糖生产乙醇的菌株，经过复筛最后获得1株乙醇得率较高、发酵性能稳定的1125-3菌株，该菌株经定向驯化后木糖的利用率达92.92%，乙醇得率达12.88%。另外有些酵母的戊糖发酵能力很强，Agbogbo等采用树干毕赤酵母（Pichiastipitis）在25%葡萄糖和75%木糖或100%木糖溶液中的发酵，都获得了较高的乙醇产率。为获得优良的生物质发酵菌株，国内外学者通过诱变育种、原生质融合、基因工程技术对野生菌进行改造，来扩大发酵菌株所利用的底物。潘丽军等采用15keV的低能氮（12.5×1014ions/cm2）诱变嗜鞣管囊酵母As2.1585原始菌株获得了嗜鞣管囊酵母高产菌株mut-54。突变株mut-54对木糖的利用速率以及耐乙醇能力均高于原始菌株，发酵72h乙醇产量较原始菌株提高12.74%，且传代7次后乙醇产量稳定。宋安东等采用双灭活原生质体融合技术，以南阳酒精酵母1308（Saccharomycescerevi-siae）的单倍体D-12和嗜鞣管囊酵母P-01（Pachusolentannophilus）为亲本，获得1株可以进行全糖发酵的稳定的融合株F10，于全糖培养基上发酵，乙醇体积分数可达1.3%，比亲株P-01（0.95%）提高了36.8%。Mogagheghi等将发酵木糖和阿拉伯糖代谢所需的7个基因整合到运动发酵单胞菌（Zy－momonasmobilis（206C[pZB301]））的染色体上，产生新的菌株可发酵40g/L葡萄糖、40g/L木糖和20g/L阿拉伯糖的混合糖液，反应50h 内消耗完葡萄糖和木糖以及消耗75%的阿拉伯糖，乙醇最终得率为43%~46%。3.2发酵方式根据目前研究情况可将发酵工艺流程大体分为：分步水解发酵、同步糖化发酵、直接微生物转化等。分步水解发酵（separateenzymatichydrolysisandfermentation，SHF）是木质纤维素生物质糖化和发酵分别在不同的反应器中进行。其优点是糖化（纤维素酶最适温度45~50℃）和发酵（产乙醇微生物最适温度28~37℃）都能够在各自最适条件下进行；缺点是糖化过程中葡萄糖和纤维二糖的积累会抑制纤维素酶的活力，最终导致产率的降低。研究发现，当葡萄糖浓度达3g/L时，β-葡糖苷酶的活力将降低75%，纤维二糖的浓度达到6g/L时，纤维素酶的活力将降低60%。同步糖化发酵（si－multaneoussaccharificationandfermentation，SSF）技术可解决高浓度糖对纤维素酶的抑制问题，但难点在于选择合适的反应温度，需要既能够适于糖化纤维素酶又能满足发酵菌株发酵，另一不足是SSF中菌种不能回收重复利用。直接微生物转化（directmicrobialconversion，DMC）又称联合生物加工（CBP），是将多糖水解酶的产生、水解糖化、混合糖发酵融入一个反应器中，整个过程由一种或多种微生物共同作用，来降低底物和原料的消耗及纤维素酶的成本。Guedon等利用电转化技术将Zymomonasmobilis的丙酮酸脱羧酶和乙醇氢酶基因导入分解纤维素梭杆菌（Clostridiumcellu－lolyticum），获得的新菌株与野生菌株相比，发酵145h后纤维素降解率提高150%，乙醇浓度增加53%。这项研究表明，利用基因工程技术获得C.cellulolyticum菌可以大大提高纤维素发酵的效率。4结束语 5/6用木质纤维素制燃料酒精的开发取决于若干关键技术，即原料的前处理、酶解以及发酵的菌种、发酵方式和发酵抑制物的去除。需同时采用这些技术来为最后发酵生产酒精作好准备，其中原料的前处理最为关键。前处理技术决定抑制物的产生、酶解程度以及最终酒精产量。一直以来，以木糖聚合的半纤维素未被用来发酵生产酒精，造成制燃料酒精工艺中半纤维素成分的浪费。伴随着纤维素和半纤维素利用于产酒精，前处理工艺会发生变化，以去除木质素，且获得高回收率葡萄糖和木糖的前处理方法将会是未来发展的方向。今后，木质纤维素制酒精的生产工艺将以获得高回收率的葡萄糖和木糖并同时发酵产酒精为方向，将会使发酵产酒精理论产量和实际产量都大幅提高，以使木质纤维素制燃料酒精的生产成本降低，为大规模的工业化运用奠定基础。参考文献[1]黄加军，杜金宝，纤维素酒精预处理技术进展（2013）[2]彭姿，谭兴和，木质纤维素糖化前预处理新技术研究进展（2013）[3]KangHW，KimY，KimSW，etal．Cellulosicethanolproductionontemperature－shiftsimultaneoussacchari-ficationandfermentationusingthethermostableyeastKluyveromycesmarxianusCHY1612［J］．BioprocessandBiosystemsEngineering（2012）[4]张雯，以木质纤维素为原料的燃料乙醇生产工艺及废水零排放技术研究（2011）[5]BaiFW，AndersonWA，Moo－ 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