血吸虫试剂盒主要原材料研究资料

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1、血吸虫抗体快速检测试剂盒主要原材料的研究资料1．血吸虫可溶性虫卵抗原（SEA）（试剂盒检测点原料）（1）制备方法：取人工感染1500条日本血吸虫尾蚴45d的家兔肝脏，用生理盐水洗净后经高速捣碎机捣碎，分样筛分离除去肝脏组织，沉淀离心，收集分离虫卵，依次经200目和300目尼龙绢过滤，收集滤渣，即为较纯净的血吸虫虫卵。然后加入10倍量的生理盐水，置玻璃匀浆器内制成匀浆，用超声粉碎机超声处理（1min×10次），液氮冻融3次，最后以10000r/min离心30min，上清液即为血吸虫可溶性虫卵抗原（SEA），经0.22um超滤膜过滤除菌后分装，―20℃冻存备用。（2）抗原性

2、测定a．测定方法1)取抗原200µl加入比色杯内，用分光光度计测定A280和A260OD值；2)将抗原用pH9.6碳酸盐缓冲液作1:4、1:8、1:16、1:32、1:64稀释,分别包被于酶标板内(100ul/孔),37℃3小时；然后倾去抗原液,用洗涤液洗涤3次,每次5分钟；BSA（0.5mg/ml)为对照，同法操作；3)加样：分别加已作1:100稀释的血吸虫抗体检测质控品、阳性和阴性对照血清各100µl，空白孔仅加100µl稀释液。置于湿盒内，37℃培育30分钟；4)洗板：取出酶标板，甩去孔内液体，每孔注满洗涤液洗涤5次，每次均需停留30秒后再甩净拍干；5)加酶标结合

3、物：除空白对照孔外，每孔加入酶标结合物2滴，37℃培育30分钟；6)洗板：同3；7)显色：每孔加底物和显色剂各1滴，混匀，37℃避光反应10分钟，加终止液1滴，混匀，判断结果。b．判断依据：1)根据公式计算：样品浓度（mg/ml）=（1.45×A280-0.74×A260）×稀释倍数；2)肉眼观察：不加终止液观察，基本无色或微蓝色为阴性，呈明显蓝色为阳性；3)仪器判断：酶标仪上450nm读取OD值，待检样本孔的OD值大于阴性对照2.1倍者为阳性。c．结果抗原OD值A280nm2.1510抗原OD值A260nm2.5121计算公式抗原浓度（mg/ml）=（1.45×A28

4、0-0.74×A260）×稀释倍数；抗原浓度1.26mg/mlSJK-DIGFA-008第7页共7页血吸虫抗体快速检测试剂盒主要原材料的研究资料　　　　比值SEA阴参阳参血吸虫抗体检测质控品阳参血吸虫抗体检测质控品1:40.050.450.159.033.081:80.040.510.1710.263.481:160.050.520.1910.313.781:320.050.490.189.413.521:640.060.610.2410.924.35BSA0.010.040.010.820.11结论：浓度为1.26mg/ml，经倍比稀释，用于ELISA检测血吸虫抗体阳

5、性临界血清，1:64(0.02mg/ml)仍呈阳性结果，具有高度的免疫原性,可用于血吸虫抗体检测（3）工作浓度：SEA的作用是作为检测点，包被于硝酸纤维素膜上，用于检测人血清中特异性抗血吸虫抗体。因此，其工作浓度的选择对于检测效果的评价是试剂盒研制的关键技术。如果浓度过高，阳性反应色度过强，易产生假阳性结果；反之，浓度过低，则不易辨别，影响检测的灵敏度。所以，研究目的是选择能较清晰产生反应色度的最低抗原浓度。方法：a.SEA抗原原液浓度测定：以紫外分光光度法测定SEA抗原原液A280和A260OD值，根据公式计算浓度（mg/ml）=1.45×A280-0.74×A260

6、；b.SEA稀释：以0.02mol/LpH8.0PBS将SEA从1:2至1:10稀释成9个稀释度，与原液一起分成10个浓度组。c.包被：将上述10个浓度的SEA分别点膜，在每块空白反应板中的硝酸纤维素膜（德国Schleicher&SchuellBioscience，孔径0.45um）上点滴1ul，每个浓度组包被3块，室温干燥2小时后加入2滴封闭液（主要成分为牛血清白蛋白），待干。d.效果测试：分别在上述10个浓度组的金标反应板中央小孔内滴加2滴洗涤液，渗入后于反应板中央加25µl血吸虫抗体检测质控品（参照血吸虫病抗体诊断试剂国家参考品低感染度血清(P13)制备，方法见附

7、页），待液体充分吸入，加2滴洗涤液，渗入后分别加3种浓度的显色液（即金标二抗，浓度依据A520OD值确定，制备方法见后），每块反应板加1种浓度的显色液，每种显色液均加4滴，最后加2滴洗涤液，渗入后根据检测点颜色深浅判断效果。结果：a.SEA抗原原液OD值：A280为2.1510，A260为2.5121，根据公式（mg/ml）=1.45×A280-0.74×A260计算，浓度为1.26mg/ml。SJK-DIGFA-008第7页共7页血吸虫抗体快速检测试剂盒主要原材料的研究资料b.检测效果金标二抗浓度SEA抗原稀释度原液1:21:31:41