骨髓细胞染色试验步骤

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1、【实验原理】染色体是染色质的高度凝集状态，化学成分与染色质相同，都由DNA和组蛋白等成分组成。在细胞分裂中期染色体的形态最清晰，最易于观察。动物骨髓细胞是制作动物细胞染色体标本的理想材料。骨髓细胞始终保持较强的分裂活性，且细胞数量较多，给动物活体内注射秋水仙素，可以抑制细胞分裂时的纺锤体形成，使处于增殖状态的骨髓细胞停止在中期。从而收集到较多的中期分裂相，通过低渗处理，可使细胞膜胀破、染色体分散；固定液处理使染色体结构清晰。为此，骨髓细胞制备染色体标本比利用其它组织可获得更多的分裂相。同时该方法还具有简便易行，不需要特殊的设备和无菌操作等优点。【实验用品】1．

2、器具：显微镜、离心机、恒温水浴箱、天平、酒精灯、火柴、预冷载玻片、解剖盘、剪刀、镊子、吸管、10ml刻度离心管、试管架、5ml注射器、染色架、二甲苯、香柏油、擦镜纸。2．材料：小白鼠。3.试剂：0.01%的秋水仙素、0.075mol/LKCl、Carnoy固定液、10%Giemsa染液。【试剂配制】1．0.01%的秋水仙素：秋水仙素10mg，加灭菌生理盐水至100ml。（抑制微管聚集，纺锥丝不能形成，使染色体停留于中期时像，具最典型形态）2．0.075mol/LKCl：称取KCl5.6g,加蒸馏水至1000ml。3．Carnoy固定液：甲醇与冰醋酸按3：1容积

3、比混合即可。4．10%Giemsa染液：（1）贮存液：Giemsa粉末1g、纯甘油66ml、甲醇66ml.称取Giemsa粉末1g置于研钵中，加少量甘油充分研磨，成无颗粒糊状。再将全部甘油加入，置于560C温箱2小时，然后加入甲醇混匀，静止1天后过滤，保存于棕色瓶中，2周后即可使用。（2）1/15mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.8)：A液（1/15mol/LKH2PO4）：称取KH2PO4?9.08g，加蒸馏水至1000ml，混匀溶解即可。B液（1/15mol/LNa2HPO4﹒2H2O）：称取Na2HPO4﹒2H2O11.88g，加蒸馏水至1000ml，混匀

4、溶解即可。C液（1/15mol/L磷酸盐缓冲液pH6.8）：取A液50.8ml，B液49.2ml混匀后即可。现配现用。（3）工作液：临用时将贮存液与C液按1：9稀释即可。【内容与方法】1）动物预处理：取材前3～4小时，按4～6μg/g体重的剂量向小白鼠腹腔注射0.01%的秋水仙素。（注意不要伤及内脏）2）取材、收集细胞：用颈椎脱臼方法处死小白鼠，立即用剪刀、镊子剥离小鼠后肢大腿的皮肤和肌肉，暴露股骨及其两端的关节，从两端关节处剪下股骨，剔除骨上残余的肌肉。剪下股骨两头端部，暴露骨髓腔，用镊子夹住股骨中部，使股骨垂直且下端对准离心管口，用5ml注射器（6号针头）

5、吸取0.075mol/LKCl溶液1ml，从股骨上端将针头插入骨髓腔，冲洗腔内的骨髓细胞，反复冲洗数次，直至骨髓腔发白为止，此时离心管中的细胞悬液可达4～5ml。3）低渗：离心（1000/5min）后弃上清，加0.075mol/LKCl溶液至5ml，用吸管将离心管中的细胞悬液充分打匀，置于37C恒温水浴箱中，低渗处理25～30分钟。(使细胞中的染色体充分分开，便于计数和观察)4）预固定：离心，弃上清，在低渗后的收集液中加入新配置的Carnoy固定液至5ml并立即混匀，37度10min平衡后以1000r/分离心8分钟。弃掉上清液，留取沉淀约0.5ml。5）固定：

6、用吸管沿管壁缓慢加入Carnoy固定液5ml，轻轻将沉淀冲散打匀，室温静止20分钟后，以1000r/分离心8分钟。弃掉上清液，留取沉淀约0.2ml左右（视沉淀多少而定）。再加Carnoy加固定液2～3滴，用吸管轻轻吹打混匀制成细胞悬液。6）滴片：用吸管吸取细胞悬液少许，滴在清洁预冷过的载玻片上，滴片距离为10～15cm(指滴管口与玻片的距离)。每片滴2～3滴，然后立即用嘴对准所滴的液体轻轻吹气，使液体在玻片上散开，随即将载玻片在酒精灯火焰上掠过1～2次（标本面朝上，且不要离火焰太近），稍干即可。用记号笔在标本面标号。置空气中自然干燥。7）染色：将标本置于染色架

7、上，标本面朝上，用吸管吸取10%Giemsa染液1～2ml滴到玻片标本上，染色10分钟后，用流水冲去染液，晾干。8）观察：将制备好的标本先置于低倍镜下观察,寻找染色体分散的中期分裂相，移至视野中央，然后换高倍镜选择染色体形态好、分散均匀、不重叠的中期分裂相观察：①染色体数目的观察：进行计数前，应先按照该细胞的染色体自然分布状态，大致划分为2～3个区域，然后按顺序数出各区域的染色体的实际数目，最后累加在一起，即为该细胞的染色体总数。小鼠二倍体细胞染色体数目为：2n=40；②染色体形态特征观察：小鼠染色体形态全部为近端着丝粒染色体，呈“U”形，染色体核型按照染色体

8、从大到小分为四组。性染色体雌性为XX，