2010食品生物技术实验-基因工程

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1、实验一、实验二动物组织DNA的提取及核酸浓度的测定一．实验目的1.掌握DNA的提取原理和方法；2.学习紫外线（UV）吸收法测定核酸浓度的原理。二．实验原理1.CTAB法提取动物组织DNA：CTAB法原理：CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸的特性。在高离子强度的溶液中(>0.7mol/LNaCl)，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。2.紫外吸收法测定核酸的含量和纯度：组成核酸分子的碱基，均有一定的

2、吸收紫外线特征，最大吸收值在波长为250-270nm之间。例如，腺嘌呤的最大紫外线吸收值在260.5nm，胞嘧啶为267nm，鸟嘌呤为276nm，胸腺嘧啶为264.5nm，尿嘧啶为259nm。这些碱基与戊糖，磷酸形成核苷酸后，其最大吸收峰不会改变，但核酸的最大吸收波长是260nm，吸收低谷在230nm。这个物理特性为确定核酸溶液浓度提供了基础。在波长260nm紫外线下，1OD的光密度相当于双链DNA浓度为50μg/mL，单链DNA或RNA为40μg/mL，单链寡聚核苷酸为20μg/mL。可以此来计算核酸样品的浓度。分光光波法不但能确定核酸的

3、浓度，还可通过测定在260nm和280nm的紫外线吸收值的比值(A260／A280)估计核酸的纯度。三．实验仪器与试剂1.实验仪器紫外/可见分光光度计、电子天平、台式高速离心机、恒温水浴锅、微量移液枪、漩涡振荡混匀器2.实验试剂细胞裂解液（50mMTris-HClPH7.5；1.5%CTAB；1MNaCl；15mMEDTA）；沉淀液（1%CTAB；50mMTris－HClPH7.5；10mMEDTA）；20mg/ml蛋白酶K；氯仿；1.2MNaCl；RNase；3MNaAc；冰乙醇；超纯水；四．实验步骤1．动物组织DNA的提取及质量鉴定1.

4、1消化称取100mg动物组织肌肉柱，冲洗干净，用无菌纸吸干，切碎；然后加入400ul裂解液（50mMTris－HClPH7.5；1.5%CTAB；1MNaCl；15mMEDTA）和12ul20mg/ml蛋白酶K，置于55℃中过夜。1.2提取①将过夜的肌肉柱加入600ul氯仿，混合3min，静置2min，12000g离心2min。②取上清，加入500ul氯仿，颠倒混合1min，12000g离心2min。(重复上述步骤直至上清无沉淀)③取上清，加入500ul沉淀液（1%CTAB；50mMTris－HClPH7.5；10mMEDTA；）混匀，静置

5、2min，65℃水浴10min。④12000g离心10min，弃上清，留沉淀。⑤加入200ul1.2MNaCl，轻轻混匀至DNA完全溶解，再加入6ulRNase，置于37℃下15min。⑥加入1ml冰乙醇和100ul3MNaAc，-20℃下5min，中间混匀一次，15000g离心10min，所得沉淀即为DNA。⑦弃除上清，再加入1ml70％冰乙醇清洗，12000g离心5min。⑧将DNA沉淀于无菌空气中晾干，加入20ul无菌水溶解沉淀，置于4℃备用。2．紫外吸收法测定核酸的纯度和得率①取6μL待测DNA样品，用蒸馏水稀释至3ml(500倍)

6、。②用蒸馏水做空白，在260nm、280nm、310nm处调节紫外分光光度计的读数至零。③加入待测DNA样品在三个波长处读取OD值。④根据OD值计算DNA浓度或纯度。[dSDNA]=50×（OD260-OD310）×稀释倍数纯DNA样品的OD260/OD280大约为1.8，若OD260/OD280介于1.7-1.9之间，说明DNA质量较好，1.8为最佳；低于1.8说明有蛋白质污染，大于1.8说明有RNA污染。五．注意事项1.动物组织尽量剪碎，以提高DNA的抽提效率；2．氯仿除蛋白过程，重复几次，直到氯仿和水的界面没有蛋白质的沉淀，上清澄清；

7、3．用70%乙醇清洗DNA沉淀后，尽量把酒精除干净，必要可以用滤纸条小心吸干；六．实验思考与总结1．提取DNA的过程原理、所添加试剂的作用实验三、实验四线粒体COI基因的PCR扩增及凝胶电泳一．实验目的1.了解mtDNA的基本特性；1.掌握PCR的原理与过程；2.掌握DNA凝胶电泳的原理。二．实验原理动物细胞的mtDNA是共价闭合的双链DNA，基因组小，分子量范围在1512～1918kb之间，基因组中不含间隔区与内含子、无重复序列，无不等交换，无基因重组、倒位、易位等畸变。与核基因组不同的是线粒体基因组严格遵守母系遗传方式，因而1个个体就可

8、以反映出整个母系集团的情况。线粒体DNA由于具有进化速度快、母系遗传和分子简单易于分析等特点而成为研究近缘种间和种内群体间遗传分化、动物群体遗传学和系统进化研究的重要对象。动物组