利用脂肪酶催化水相中酯合成反应的研究

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1、利用脂肪酶催化水相中酯合成反应的研究胡晓燕宋欣魏留梅曲音波(山东大学微生物技术国家重点实验室济南　250100)   酯合成反应和酯水解反应是由脂肪酶催化的一对可逆反应，因为水使平衡向水解方向移动，因此在水相中进行的酯合成反应往往效率较低，所以十几年来，对酯合成反应的研究一直集中在有机相中酯合成反应的研究上[1,2]。虽然有大量研究认为有机溶剂的存在是有利的，例如在控制水活度和防止微生物污染方面，但无溶剂存在时，脂肪酶催化的酯合成和醇解反应对于工业应用来说也非常重要。比如在食品应用方面，无溶剂系统因为没有有机溶剂的存在，因此产物的后处理过程简单，而且安全性提高[3]。此外，研究发现不同种类

2、的醇对于水解反应都有一定的抑制作用，因而在一定程度上可促进酯合成反应的进行。而且对于某些醇来说，水相中酯合成反应的效率较高，因而有一定的应用价值。1材料与方法1.1试剂   甲醇，乙醇，丙醇，丁醇，戊醇，己醇，庚醇，以及油酸，以上试剂均为分析纯。1.2脂肪酶水解活力测定   按照Yamada等的橄榄油底物乳化法进行测定[1]。在30°C，pH8.0对橄榄油乳化液水解反应10min，以每分钟产生1mmol脂肪酸所需的酶量定义为一个单位(U)。1.3酯合成程度的测定   用丙酮-乙醇混合液终止反应，然后用酚酞甲醇溶液作指示剂，用0.01mol/LNaOH甲醇溶液滴定。将所得的NaOH消耗量转化

3、成油酸消耗量，进而计算酯合成百分率。2醇对水解的抑制作用2.1不同浓度甲醇对水解的抑制作用   反应系统为：4mL橄榄油乳化液，5mL磷酸缓冲液(pH7.0)，15mgCCL酶粉，不同体积的甲醇，30°C振荡反应10min后，用10mL乙醇终止反应，然后用0.01mol/LNaOH甲醇溶液滴定。对照反应结束，再加入相同量的甲醇。   结果表明在低浓度时，甲醇对脂肪酶的水解作用有利，而在较高浓度时，便表现出对水解的抑制作用，当甲醇量为5mL时，其抑制作用已非常明显。因而，当以甲醇为底物进行酯合成反应时，较高的浓度不仅有利于酯合成反应的进行，而且由于甲醇对水解的抑制作用，进一步提高了酯合成效率

4、。2.2其它醇对水解的抑制作用与其酯合成效率的关系2.2.1反应系统：   (1)酯合成反应系统：0.014mmol各类醇，1g油酸，150mgCCL酶粉，1.5mL磷酸缓冲液(pH7.0)，30°C振荡反应48h，用丙酮-乙醇萃取后，用0.01mol/LNaOH甲醇溶液滴定。   (2)水解抑制反应系统：0.014mmol各类醇，4mL橄榄油乳化液，5mL磷酸缓冲液(pH8.0),20mgCCL酶粉，30°C振荡反应10min，用10mL乙醇终止反应，然后用0.05mol/LNaOH溶液滴定。2.2.2结果与讨论醇溶解性酯化率/%抑制效率/%甲醇易溶81.7-3.1乙醇易溶42.4-6.

5、7丙醇易溶19.1-42丁醇微溶27.992.4己醇微溶62.781.9辛醇不溶43.271.8癸醇不溶22.767.2   (1)   从上表中可看出，甲醇，乙醇和丙醇对水解都有一定的促进作用，而且促进作用越大，酯化率越低，这是因为酯合成反应和水解反应是可逆反应，因此促进水解的进行必然导致酯合成效率的降低。而丁醇、己醇、辛醇和癸醇对水解都有一定的抑制作用，且抑制作用随分子量增加而减弱，而抑制作用与酯合成效率之间却无明显的正比关系，说明酯合成效率不仅与醇的抑制作用有关，而且可能存在其他的影响因素。而且与易溶性的醇相比，它们有一个共同特征，即在水解反应结束后，发现有油脂出现，分析可能是因为醇

6、将油脂从乳化液中置换出来，导致底物减少，从而使水解反应减弱，那是否对于丁醇等醇来说，也存在象甲醇一样的现象(见图1)。为进一步分析原因，设计以下实验。      图1甲醇对酯水解的抑制作用(2)不同体积的丁醇对水解反应的影响   反应系统：不同体积的丁醇，4mL橄榄油乳化液，1g油酸，150mgCCL酶粉，5mL磷酸缓冲液(pH7.0)，30°C振荡反应10min，然后丙酮-乙醇萃取，用0.01mol/LNaOH溶液滴定。   结果表明，丁醇浓度对水解的抑制作用影响很大，存在与甲醇同样的现象，在低浓度时，有促进作用，当其浓度为0.2mL时，即开始有抑制作用。说明丁醇对水解的抑制作用不是因为

7、其将油脂置换出来，而是可能有其它的原因存在。   图2丁醇对酯水解的抑制图3丙醇对酯水解的抑制(3)不同体积的丙醇对水解反应的影响   反应系统：不同体积的丙醇，4mL橄榄油乳化液，1g油酸，150mgCCL酶粉，5mL磷酸缓冲液(pH7.0)，30°C振荡反应10min，然后丙酮-乙醇萃取，用0.01mol/LNaOH溶液滴定。   结果表明，丙醇也存在与甲醇和丁醇同样的现象，至于为何有这样一个最优点，机制尚不清楚，有