固定化葡糖淀粉酶：通过高度活化的乙二醛琼脂糖载体共价修饰酶表面

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1、固定化葡糖淀粉酶：通过高度活化的乙二醛琼脂糖载体共价修饰酶表面摘要：商业糖化酶固定不变的高活性乙二醛琼脂糖载体非常缓慢。所得衍生物是只有6倍比可溶性酶更稳定。只有6倍，比水溶性酶更稳定。未修饰的淀粉酶，高度糖基化的，只有少量赖氨酸能够与载体上乙二醛基团反应。因此，酶表面通过羧基的化学修饰高度富集的氨基组（带碳二亚胺激活）与乙二胺。胺化的酶保持了良好的活性（80％）和它的百分表现出相同的稳定性比未修饰的酶。固定化酶的固定化非常迅速的高活性乙二醛琼脂糖载体。新生成的衍生物保留活性的50％，是超过500倍，比在热灭活的实验可溶性酶更稳定

2、。1简介葡糖淀粉酶（α-1,4-D-葡聚糖葡糖水解酶，EC3.2.1.3），也称为淀粉葡糖苷酶（AMG），是一种外切酶作用于从直链淀粉，支链淀粉和糖原的非还原端以连续的方式释放出1,4-糖苷键D-葡萄糖。它也水解α（1→6）和α-（1→3）糖苷键，但与水解α（1→4）键速率相比慢得多。葡糖淀粉酶是一种工业上重要的酶和它用于麦芽寡糖大量转化成葡萄糖和食品、饮料和发酵工业中所需的各种糖浆。该工业过程将通过使用固定化系统将更具经济效益，因为它们允许酶的再利用和常常导致也在针对不同的失活酶的稳定性的提高剂，例如，高温。葡糖淀粉酶的固定化已

3、被使用各种载体（无机材料，聚合物，磁性粒子的研究，等）和不同的酶-载体偶联方法，如吸附或共价偶联到固体基质中所需的各种糖浆，以及由包封或封装在聚合物质。其他作者描述回收值从5至90％。然而，热稳定已经非常低（低于5倍）。固定化酶衍生物必须非常稳定，以便对许多反应循环是有用的。许多用于酶固定化协议涉及酶在预先存在活化的载体的简单共价附着（戊二醛，溴化氰所需的各种糖浆，NHS活化载体等）。温和的固定化处理之后（例如，在形成酶和载体之间的单点共价连接的）的关键酶性质（即，3D稳定）没有得到很大的提高。与此相反，多点共价连接可促进与此相关

4、的稳定的酶结构的硬化效果。事实上，在我们的实验室中，令人关注的稳定性已通过使用高度活化乙二醛活化载体改进的固定化的协议来实现。乙二醛琼脂糖凝胶通过具有最高量的赖氨酸残基中所需的各种糖浆，即进一步的多点共价连接最大可能性，可以实现其表面区域有利于酶的第一个共价固定。这可能对酶的稳定性是一个显著影响。未修饰的葡糖淀粉酶在这项工作中，固定化在不同的高度氨基化的酶和高度活化乙二醛-琼脂糖载体进行了研究。固定化率，酶活性的保存和热稳定的不同固定化衍生物进行了研究。2.材料与方法2.1材料糖化酶（AMG200L），黑曲霉捐赠诺维信公司A/S（

5、Bagsvaerd中所需的各种糖浆，丹麦）；葡萄糖氧化酶（47,200units/克，固体）从A型到II-S、尼日尔和过氧化物酶（113Purpurogalin单位/mg固体）自有限公司（圣路易斯中所需的各种糖浆，MO）Sigma化学购辣根I型；淀粉购买自Acros有机物（新泽西州，美国）；交联琼脂糖珠6和10％的（重量/体积）从ABT（琼脂糖珠科技）（马德里中所需的各种糖浆，西班牙）购买。DEAE琼脂糖4B是从GE-Healthcase生物科学AB（Uppsala的购买中所需的各种糖浆，瑞典）。2,3-环氧-1-丙醇（glycy

6、dol），乙二胺（EDA），2,2-连氮基-双（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）中所需的各种糖浆，hydrochlo-骑N-（3-二甲基氨基丙基）-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐（CDI）和硼氢化钠购自Sigma化学购买。有限公司（圣路易斯，密苏里州，美国）。高碘酸钠自Fluka（NEU乌尔姆中所需的各种糖浆，德国）购买。有机溶剂和所有其他试剂均为分析纯。2.2纯化商业AMG添加剂加入到商业酶制剂稳定酶分子。一些添加剂被吸附在酶表面，阻碍酶表面与活化的载体之间的相互作用（数据未示出）。除此之外，添加剂由于固定化酶的存在可以

7、影响真正的稳定因素，（固定化酶的半衰期和可溶性酶之间比率）。这样，在商业AMG的纯化中，以消除所述稳定的添加剂。商业AMG通过DEAE琼脂糖吸附/脱附法纯化，然后通过透析针对于4℃在温和搅拌过量的磷酸钠缓冲液，pH7.0为24小时，并使用10至12kDa的截止膜。2.3酶活性测定可溶性和固定化AMG的酶活性在25℃下，在pH6.5，50mM柠檬酸盐缓冲液中制备加入1g/L淀粉底物，在pH为6，浓度为50mM磷酸盐缓冲液，中制备的葡萄糖氧化酶-过氧化物酶-ABTS体系，用的比色法测定葡萄糖产生的初始反应速率。通过测定吸光度，最大吸收

8、波长在405nm。反应混合物含有所需的各种糖浆0.5ml葡萄糖苷（2.5克/升），过氧化物酶0.5毫升（2.5克/升），0.4毫升ABTS（1mM）和1克/升淀粉溶液1ml。通过在反应物加入25-200μ升的水溶性酶溶液开始反应，或加入固定化酶使反