分子生物学常用实验技术及方法

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1、第二章常用实验技术及方法一、聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction,PCR)反应总体积为50µl，其中含有：模板DNA0.5µlPCR缓冲液(不含MgCl2)5µl10×MgCl2溶液5µldNTP(2.5mmol/L)0.5µl引物1(50umol/L)0.5µl引物2(50umol/L)0.5µlTaqDNA聚合酶0.5µl无菌去离子水加至50µl上层用25µl液体石蜡油覆盖。循环参数为：94℃变性10min94℃变性1min56℃退火1min72℃延伸2min共30个循取环，PCR结束后，取2µlPCR扩增产物，经1%琼脂糖凝胶电泳

2、，在紫外检测仪上观察并拍照。二、基于PCR技术的定点突变1.根据所要突变位点的特定氨基酸，并按公认的四引物法原理，分别设计上下游引物Primer3和Primer4，这两条引物部分交错互补，但分别含有欲突变后的碱基（红点）的互补序列（如下图所示）；P1P2P4P32.用基因5’端的Primer1和Primer2PCR扩增DNA片段1，用基因3’端的Primer4和Primer3一起PCR扩增DNA片段2，PCR反应条件基本如上(七、聚合酶链反应)，可根据具体实验略有调整，反应完毕后，分别电泳回收DNA片段1和DNA片段2；3.以片段1和片段2为模板，进行第二次P

3、CR反应，反应体系为50µl：片段11µl片段21µl10×PCR缓冲液(不含MgCl2)5µl10×MgCl2溶液5µldNTP(2.5mmol/L)5µlTaq酶1µl加ddH2O至50µl在该反应体系中先不加入引物，按上述反应条件进行10个循环，然后再加入Primer1和Primer4各1ul，按上述反应条件再扩增30个循环；4.PCR产物经电泳检查，然后连接到相应的载体中，进行测序以确定定点突变的正确性。三、TotalRNA的提取(Catrimox-14TMRNAIsolationKitVer.2.11)1.吸弃培养细胞中的旧培养基，用PBS洗涤1-2

4、次后，加入1ml的Catrimox-14TM溶液，然后充分混匀；2.收集细胞裂解液，按以下条件进行离心：细胞数<5×105：9500rpm(约5000×g)5min细胞数5×105-1×107：3000rpm(约450×g)5min细胞数>1×107：1500rpm(约112.5×g)5min3.除去上层溶液，加入1ml的DEPC处理的H2O，上下颠倒混合数次后，12000rpm离心2min；4.吸弃上层溶液，激烈振荡使沉淀松动；5.向Microtube中加入1ml的2MLiCl溶液；6.激烈振荡后，室温下12000rpm离心5min，除去溶液；7.沉淀用70

5、%冷乙醇清洗一次；8.沉淀经过简单的真空干燥后，溶于适当的缓冲液中。四、RT-PCR(TaKaRaOneStepRNAPCRKit)1.按TakaraKit中所提供的标准步骤配制PCR体系；2.按以下条件进行RT-PCR反应(1)50℃30min(2)94℃2min(3)94℃1min(4)56℃1min(5)72℃2min3.重复步骤(3)-(4)-(5)，共30个循环；4.反应结束后，取3-5µl进行琼脂糖凝胶电泳检测，并将PCR产物冷冻保存。五、DNA样品的琼脂糖凝胶电泳50×TAE:242gTris碱57.1ml冰乙酸100ml0.5MEDTA(pH8

6、.0)1.称取0.5gagarose，置于250ml锥形瓶中，加入50ml1×TAE（含EB0.5ug/ml），加热使其全部溶解；2.封口、安放梳子；3.待凝胶稍凉后铺板；4.胶凝固后，放入电泳槽中，倒入1×TAE，淹没胶面，拔去梳子；5.将DNA样品与6×的上样缓冲液混合，加于加样孔中；6.80-100V恒压电泳，待溴酚蓝走至凝胶适当位置时，停止电泳，紫外灯下观察或拍照。六、从琼脂糖凝胶上回收DNA片段（VitageneDNA片段回收Kit）1.用一灭菌刀片割下含目的DNA片段的琼脂糖凝胶块，放入Eppendorf管中；2.用VitageneDNA片段回收K

7、it，并按照试剂盒提供的步骤回收所要的DNA片段。七、DNA片段的连接反应1.总体系为10-20µl，外源DNA插入片段和载体片段按一定摩尔比混合；2.加入1-2ul10×Buffer，2ulT4DNA连接酶，混匀；3.12-16℃反应过夜。八、大肠杆菌感受态细胞的制备1.挑取单菌落接种于3-5mlLB液体培养基中，37℃振荡培养过夜；2.取0.5ml培养物转接种于50mlLB液体培养基中，37℃振荡培养约3h至对数生长期(OD600=0.4-0.6)；3.将细菌转移至50ml离心管中，冰浴20min；4.于4℃，4200rpm离心10min，弃上清；5.用5

8、ml冰预冷的0.1MCaCl2悬浮菌体