一株高效褐藻胶降解菌的筛选及其性质的初步研究

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1、一株高效褐藻胶降解菌的筛选及其性质的初步研究王丽娟展长淑孙彦粉王振杰（山东大学威海分校海洋学院，山东威海264209）摘要：从威海近海天然腐烂的海带中分离得到10株褐藻胶降解菌。以海藻酸钠为唯一碳源，通过驯化培养、初筛、复筛得到一株优势菌。本课题对该优势菌的最适生长条件及最适产酶条件进行研究，并对其酶的性质做了初步研究。关键词：褐藻胶降解菌；筛选；最适生长条件：最适产酶条件：降解酶性质Abstract:10algindegradingbacteriawereisolatedfromnaturaldecayingkelpofWeihaiof

2、fshore.Adominantbacteriahasgotthroughdomestication,screening,andrescreenedusingAlginateasasolesourceofcarbon.Intheissuewestudiedaboutthedominantbacteria,soptimalgrowthconditionsandtheconditionsforenzymeproduction,andalsoapreliminarystudyahoutthenatureofitsactivity.Keyword

3、s:Algindegradingbacteria;Screening;Theoptimumgrowthconditions;enzymeproductionconditions;Enzymenature褐藻胶(algin)是褐藻细胞壁的填充物质，是一种由α-D-甘露糖醛酸和β-L-古罗糖醛酸两种单糖组成的线形多糖[1]。褐藻胶应用广泛，但其相对分子质量较大，导致其溶解度较低，溶液粘性较大，应用受到很大限制。近年来，褐藻胶寡糖生物活性的研究取得了重大进展，如调节植物生长、诱导植物抗病能力、抗肿瘤及抗老年痴呆，以及防治海洋无脊椎动物常见病的功

4、能等[2]。因而通过各种降解方法制备的褐藻胶寡糖在糖化学、糖生物学、糖工程及糖类药物研究领域具重要的研究价值。目前褐藻胶寡糖的获取方法主要有物理降解法、酸降解法，氧化降解法和酶解法等。其中酶解法是一种条件温和、可控性强和特异性高的生物降解方法，是目前的主要研究方向[3]。因此褐藻胶降解酶具有重要的开发价值和研究意义。本项目的研究重点在于利用微生物得到降解酶并最终获得寡糖，通过诱导筛选出产酶量高、酶活性强的优势菌株，确定出其最适生长条件和最适产酶条件，并对降解酶的性质做出初步研究。1．材料与方法1．1材料1．1．1样品采集腐烂海带采集于山东

5、省威海市近海1．1．2培养基成分初筛培养基（g/L）：海藻酸钠10；硝酸钾1.0；氯化钠15；磷酸氢二钾0.5；硫酸镁0.5；硫酸亚铁0.01；琼脂15-20；水1000mL驯化培养基（g/L）：褐藻酸钠；氯化钠15；蛋白胨1.0；磷酸氢二钾1.0；磷酸二氢钾1.0；磷酸氢二钠1.0；硫酸镁0.5；硫酸亚铁0.01；水1000mL复筛及发酵培养基（g/L）：褐藻酸钠10;硫酸铵5.0;磷酸氢钾2.0;氯化钠l5；硫酸镁1.0；硫酸亚铁0.01；酵母膏1.0;水1000mL保藏培养基（g/L）：牛肉膏5.0；蛋白胨10；磷酸氢二钠2；氯化钠

6、5;琼脂5-7;水1000ml；PH7.4-7.61．2实验方法1．2．1菌株的驯化用海水浸泡天然腐烂海带，制备菌悬液，取1ml菌悬液移入到30ml含海藻酸钠2g/L的驯化培养基中，同时观察培养液的变化，3天后，取1ml驯化液至新鲜驯化培养基中，海藻酸钠浓度按4、6、8、10g/L逐步提高，共驯化5代。1．2．2菌种的分离取第5代培养液适当稀释后涂布于牛肉膏蛋白胨培养基平板上。30。C培养72小时。待菌落长好，挑取不同形态特征的菌落，划线分离直至得到纯化的单菌落。1．2．3菌种的初筛将分离得到的单菌落接于初筛平板上，置30。C培养72小时

7、后，选取在平板上生长的菌株，接种到斜面4。C冰箱保藏备用。1．2．4菌种的复筛1．2．4．1制备液体菌株将30ml发酵培养基装入100ml三角烧瓶中，于121.5。C灭菌。挑取一环新鲜的初筛菌株斜面种子，于28。C摇瓶培养48小时。1．2．4．2在100ml三角烧瓶中装入发酵培养基50ml按2%（体积分数）的接种量接入液体菌种，28。C摇瓶培养72小时后测定发酵培养基中生物量,并用3，5-二硝基水杨酸法酶活。对菌体用细胞破碎仪进行破壁后再测酶活。1．2．4．3寡糖含量与生物量的测定生物量的测定：用721型分光光度计为620nm处测定发酵液

8、的吸光度值，以空白发酵培养基作对照。寡糖含量的测定：本实验采用两种方法测定寡糖含量。第一，可用3，5-二硝基水杨酸法测定酶解产物中还原糖的含量。反应体系溶液包括，1.0ml1%海藻酸钠溶液，4