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时间:2018-07-17
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1、1.HPLC分析型与制备型的区别两个的用途完全不一样,分析型是用来做样品定性,纯度检测的,制备型是用来快速分离和纯化产品的。主要是分析型的样品通量很小,而制备型的通量是分析型的几百倍上千倍,为了达到这个效果,制备型选用的是大流速的泵(几十毫升每分钟甚至上百毫升没分钟),粗粒径填料,粗管径的色谱柱,以提高柱子的载样量,同时牺牲的是分离效率,制备型一次可以制备毫克级的样品,甚至大型的专用制备仪器可以制备克级的样品2.高效液相色谱的优点和常见问题高效液相色谱(HighPe-rformanceLiauidChromatography,HPLC)
2、的主要优点是⑴分辩率高于其它色谱法;⑵速度快,十几分钟到几十分钟可完成;⑶重复性高;⑷高效相色谱柱可反复使用;⑸自动化操作,分析精确度高。根据分离过程中溶质分子与固定相相互作用的差别,高效液相色谱可分为四个基本类型,即液-固色谱、液-液色谱、离子交换色谱和体积排阻色谱。高效液相色谱在生物领域中广泛用于下列产物的分离和鉴定:⑴氨基酸及其衍生物;⑵有机酸;⑶甾体化合物;⑷生物硷;⑸抗菌素;⑹糖类;⑺卟啉;⑻核酸及其降解产物;⑼蛋白质、酶和多肽;⑽脂类等。 高效液相色谱的常见问题有: 1、涡流扩散(Eddydiffusion) 流动
3、相碰到较大的固体颗粒,就像流水碰到石头一样产生涡流。如果柱装填得不均匀,有的部分松散或有细沟,则流动相的速度就快;有的部位结块或装直紧密则流就慢,多条流路有快有慢,就使区带变宽。因此,固相载体的颗粒要小而均匀,装柱要松紧均一,这样涡流扩散小,柱效率高。 2、分子扩散(Moleculardiffusion) 分子扩散就是物质分子由浓度高的区域向浓度低的区域运动,也称纵向分子扩散。要减少分子扩散就要采用小而均匀的固相颗粒装柱。同时在操作时,如果流速太慢,被分离物质停留时间长,则扩散严重。 3、质量转移(Masstransfer)
4、 被分离物质要在流动相与固定相中平衡,这样才能形成较窄的区带。在液相色谱中,溶质分子要在两个液相之间进行分配,或在固相上被吸附和解吸附均需要一定的时间。当流速快时,转移速度慢,来不及达到平衡动相就向前移,这各物质的非平衡移动,使区带变宽。 4、动相流速 当流速太低时,分子扩散严重,特别是在气相色谱中尤为突出。如将理论塔板高度对流速作图,理论塔板高度随流速增加而急速下降,当达到最低值时,流速再加大则质量转移起主要作用,理论塔板高度又加大。在高效液相色谱中,流速稍快影响不大,但在凝胶过滤色谱中,因为物质要渗透到凝胶内部,所以质量转移影
5、响大,流速咖大会降低柱效率。 5、固定相颗粒大小 定相颗粒越小柱效率越高,对流动相流动的阻力越大,需要加大压力才能使它流动。3.国内常用的HPLC检测器特点光学类检测器1、紫外吸收检测器(UVD)是目前HPLC中应用最广泛的检测器。它的主要特点是灵敏度高,线性范围宽,对流速和温度变化不敏感,可用于梯度洗脱。它要求被检测样品组分有紫外吸收,属于选择性检测器。2、二极管阵列检测器(PDAD)是上世纪80年代出现的一种光学多通道检测器,它可以看作是UVD的一个分支。在对每个洗脱组分进行光谱扫描,经计算机处理后,得到光谱和色谱结合的三维图
6、谱。其中吸收光谱用于定性(确证是否是单一纯物质),色谱用于定量,常用于复杂样品(如生物样品、中草药)的定性定量分析。3、荧光检测器(FLD)同样属于选择性检测器,其灵敏度在目前常用的HPLC检测器中是最高的,应用也较多,仅次于UVD。它适用于能激发荧光的化合物。很多与生命科学有关的物质,如氨基酸、胺类、维生素、甾族化合物及某些代谢药物都可以用荧光法检测。荧光检测器在生物样品痕量分析中很有用,尤其在用荧光衍生后,可以检测很微量的氨基酸和肽。通用型检测器1、示差折光检测器(RID)是一种通用型检测器,只要被测组分与洗脱液的折光指数有差别就可
7、使用。生命科学中常遇到各类糖类化合物,没有紫外吸收,一般常用示差折光检测器。它的通用性比UVD广,但灵敏度要低,对温度变化敏感,并与梯度洗脱不相容,因而限制了它的使用。2、蒸发光散射检测器(ELSD)也是一种通用型的检测器,可检测挥发性低于流动相的任何样品,而不需要样品含有发色基团。ELSD的响应值与样品的质量成正比,因而能用于测定样品的纯度或者检测未知物。ELSD灵敏度比RID高,对温度变化不敏感,基线稳定,可用于梯度洗脱。现在ELSD已被广泛应用于碳水化合物、类脂、脂肪酸和氨基酸、药物以及聚合物等的检测。3、质谱检测器(MSD)是另
8、一种通用型检测器,在灵敏度、选择性、通用性及化合物的分子量和结构信息的提供等方面都有突出的优点。但它的昂贵操作费用和复杂性限制了它的推广应用。随着科技的进步,检测要求的提高,经济实力的增强,MSD定会在液相
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