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时间:2018-07-17
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1、基于脂蛋白纳米载体的小干扰RNA靶向递送方法研究基于脂蛋白纳米载体的小干扰RNA靶向递送方法研究摘要RNA干扰作为一种治疗途径尤其是恶性肿瘤的治疗具有巨大潜力。然而,系统递送siRNA需要高效和生物相容性的递送手段。肿瘤细胞通过过度表达清道夫B型1受体类(SR-B1)受体以清除HDL(HDL)粒子来维持其高生长水平。本文利用这种细胞特性来实现高效siRNA递送,通过siRNA偶联重组成HDL(rHDL)纳米粒子建立一种新型的siRNA制剂。这里,我们证实rHDL纳米粒子促进了siRNA体内高效递送。此外,概念证明治疗研究中,这些纳米粒可以有效沉默两种
2、蛋白的表达,在原位卵巢和结肠直肠癌小鼠模型中,这两种蛋白是癌症生长和转移的关键(信号传感器和转录激活因子3以及粘着斑激酶)。这些数据表明,rHDL纳米粒是一种新型、高效的siRNA载体,因此。这种新型技术可以作为新型癌症治疗方法的基础。介绍RNA干扰(RNAi)逐渐被认为是一种潜在,高效的治疗途径。这个概念根源于干扰RNA(例如,小分子干扰RNA)基因沉默的能力,传统治疗方法很难靶向这些基因,如抗体或小分子抑制剂。即使干扰RNA靶向特定基因确实很有前景的,但需要体内高效和生物相容性的siRNA递送手段来实现其完整的治疗潜力。虽然一些使用脂质体或其它纳
3、米粒子的跨膜转运方法也已经报道,但是因毒性和其他因素其治疗应用受到限制。因此,需要新型,更具有特定性的方法以系统递送siRNA。脂蛋白,尤其是HDL,是脂质运输系统的必要成分。基于脂蛋白纳米载体的小干扰RNA靶向递送方法研究HDL在胆固醇逆转中起着举足轻重的作用,通过促进外周细胞多余胆固醇返回到肝脏进行消除(胆汁排泄或在肝肠循环使用)。关于内源性,HDL纳米粒是完全可生物降解的,并且也无引起免疫反应的相关报道。此外,众所周知,HDL纳米粒可以逃避网状内皮系统的吸收,比大多数药物制剂或其他脂蛋白,他们在循环中表现出更长的滞留时间。HDL纳米粒循环的核心
4、部分就是摄取,通过清道夫受体B类1型(SR-B1)受体介导的机制,这种受体主要表达在肝脏和恶性肿瘤细胞。基于体积小,屏蔽疏水核心,受体介导的摄取能力等这些有效特征,HDL纳米粒是一种理想的药物载体。重组HDL是由人的HDL合成得到的。该rHDL纳米粒的组成部分有磷脂酰胆碱,载脂蛋白A-1,胆固醇和胆甾醇酯(图1A)。rHDL纳米粒都很小,直径约12至18纳米。为了研究siRNA靶向输送途径,一些肿瘤细胞受体已被获知。SR-B1受体主要在肝脏中的表达,也在肾上腺或正常卵巢组织也较小程度表达。然而,在恶性肿瘤细胞中SR-B1非常显著表达。增加HDL摄取可
5、使肿瘤细胞产生较高增殖率。例如,乳腺癌细胞通过增加SR-B1的表达来增加胆固醇酯的摄取。因此,考虑到SR-B1在HDL中的作用,我们认为rHDL纳米粒可以作为选择性输送的有效载体。siRNA基因沉默治疗非常有效,其他方法很难靶向这些基因。信号传感器和转录激活因子3[STAT3]都可以介导正常细胞对多种细胞因子和生长因子的反应。激活STAT3是恶性肿瘤转化和发展(例如,细胞增殖,分化和存活)的关键过程。虽然STAT3可以在许多实体瘤里激活,但是它在正常组织中表达,并且参与许多正常细胞过程。因此,使用小分子抑制剂或其他非特异性靶向STAT3的手段可能会导
6、致许多不必要的副作用,因此需要有效途径限制毒性。同样,粘着斑激酶(FAK)对于肿瘤细胞存活,转移,入侵也非常重要。在卵巢癌患者中,FAK过度表达与侵袭性肿瘤的特征相关,这有助于弱势细胞生存。概念证明,我们在卵巢癌和大肠癌模型中证实使用rHDL纳米粒靶向STAT3和FAK治疗有效性。原料与方法rHDL纳米粒的制备和siRNA的偶联siRNA偶联到rHDL纳米粒,并储存在-20°C。简单地说,载脂蛋白A-I,是rHDL纳米粒的主要核蛋白,在生产蛋白过程中用质粒载体进行分离和纯化。然后,脂类混合物(胆固醇[C]/胆固醇油酸[CE]/蛋黄卵磷脂[PC],摩尔
7、比的1:5:1.3:115)在氮气流中干燥。5mg的siRNA用25μ基于脂蛋白纳米载体的小干扰RNA靶向递送方法研究g低聚赖氨酸(平均分子量为500-2000)在30℃预先孵育30分钟,然后加入到脂质成分中。低聚赖氨酸/siRNA混合物偶联脂质,分散在60μl的DMSO和1.4ml的缓冲液(10mMTris,0.1MKCl,1mMpH为8.0的EDTA)。胆酸钠,140μL(100mg/ml溶于为PBS)形成的蛋黄卵磷脂摩和胆酸的摩尔比为1:1.6。载脂蛋白A-I(12.7mg/ml)溶于0.4mlPBS加入到混合物中,终体积用PBS调整到2ml。
8、4℃孵育12h,接着用2L的PBS透析2天,换3次透析缓冲液。制剂的稳定性凝胶排阻色谱中用的RiboGree
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