western blot分析ctp-sod的跨膜转导

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1、一．样品准备不同发酵时间的发酵液（900ul），TCA-丙酮沉淀法沉淀蛋白。1加脱氧胆酸钠至0.02％终浓度，混匀室温放置至少15min2加100％TCA至10％终浓度，混匀，室温至少放置1h34度14000转离心10分钟，弃上清，倒置干燥3加冰预冷的丙酮，混合，低温放置至少20分钟54度最高转速离心10分钟，倒上清，倒置干燥丙酮30ul一乘上样缓冲液溶解沉淀，沸水煮5分钟总体时间3小时所用试剂：转膜缓冲液：（48mmol/LTris，39mmol/L甘氨酸，0.037％SDS，20％甲醇）甘氨酸（MW75.07）2.

2、9gTris（MW121.14）5.8gSDS0.37g甲醇200ml蒸馏水至1000ml溶解后室温保存，此溶液可重复使用3～5次（此溶液最好保存在4度冰箱，最多使用5次左右，不然影响转移效率）。（先用蒸馏水溶解甘氨酸、Tris和SDS，然后再加入甲醇，最后补足液体。如果先加入甲醇，溶解甘氨酸、Tris和SDS等比较困难）（可以配制成2×转移缓冲液进行保存，稀释后使用）TBS缓冲液：（10mMTris-HclpH7.5,150mmol/LNaCl）1mol/LTris·HCl（pH7.5）10mlNaCl8.8g蒸馏水

3、至1000ml（可以配制成10×TBS缓冲液进行保存，稀释10倍使用）10×TBS:Tris12.11g，NaCl88g蒸馏水至900ml，调节pH至7.5，定容1000mlTris4.844g，NaCl35.2g。蒸馏水至350ml，调节pH至7.5，定容400mlTBST缓冲液：（含0.05％Tween20的TBS缓冲液）20％Tween201.65mlTBS700ml混匀后即可使用，最好现用现配。封闭液：脱脂奶粉5gTBST100ml最好现用现配。或者用含5%BSA的TBST溶解后4℃保存。使用时，恢复室温，用量

4、以盖过膜面即可，一次性使用。一．制备凝胶样品制备过程中，制备凝胶5％浓缩胶12％分离胶配制凝固时间：分离胶30分钟，浓缩胶50分钟电泳时间：80V二十分钟，100V100分钟左右。可以降低电压，60V80V滤纸和膜的准备(在电泳结束前20分钟应开始准备工作)。A.检查是否有足够的transferbuffer，没有立即配制。B.检查是否有合适大小的滤纸和膜。C.将膜泡入甲醇中，约1-10分钟。再转入transferbuffer中。D.将合适的靠胶滤纸和靠膜滤纸分别泡入transferbuffer中。转膜1.准备6张和凝胶

5、大小相近的滤纸和1张PVDF膜。切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。2.甲醇活性化PVDF膜：一般活化5-10min，用镊子捏住膜的一边轻轻置于有甲醇的培养皿里浸泡。3.转膜液浸泡：将电泳好的凝胶剥下，去掉浓缩胶，切割成合适大小，注意目的条带的位置。在加有转移液的培养皿中放入切好的凝胶、平头镊子、一支玻璃棒、滤纸、浸过的膜。4.在转膜液中对齐三层滤纸，用平头镊子赶出滤纸层中的气泡，夹出放在转膜仪上；分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻璃棒轻轻擀去气泡（由中间向两边赶）。将膜盖于凝胶上，要盖满

6、整个胶（膜盖下后不可再移动）并除气泡。在膜上盖3张滤纸并除去气泡。擀几下就可合起夹子。整个操作要不断的擀去气泡。5.盖上转膜仪上盖，设置好电压和时间。一般用半干转膜仪10V45-60min6转完后将膜用1×丽春红染液染1-2min（平头蘖枝夹住边缘，轻轻浸入染液）。然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白（超纯水多洗两遍，）。将膜晾干备用。封闭：将膜用TBS从下向上浸湿后，移至含有封闭液的培养皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭2h。用TBS将膜上的封闭液洗去(轻轻晃晃就可)。孵育一抗：一抗用封闭液（或者用含有5%BSA

7、的TBST）稀释至适当浓度（在1.5ml离心管中）；将PVDF膜放入PE手套中，用封口机将膜封闭，将抗体溶液加到膜的蛋白面（转膜时做好标记）赶出残留气泡；室温下孵育2h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗3次（多洗几次，多加TBST），每次10min；再用TBS洗一次，5min。孵育二抗：同上方法准备稀释二抗，摇床，室温下孵育1h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗3次，每次10min；再用TBS洗一次，5min。一抗推荐稀释比例：1:200-1:2000二抗推荐稀释比例：1:5000-1:100,0000先前做过两次实验

8、：一抗1:500，二抗1:2000，背景较重，出现非特异条带。这次做可以先把二抗浓度改为1:20000，一抗：1:5001:1000显色（HRP酶）1．增强化学发光法(ECL)Ecl显色原理：氨基苯二酰肼类主要是鲁米诺及异鲁米诺衍生物，是最常用的一类化学发光剂。鲁米诺在免疫测定中既可用作标记物，也可用作过氧化物酶的底物。在Ecl底