病理科免疫组化技术员培训

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1、病理科免疫组织化学技术员培训及技术操作规范一、病理科免疫组织化学技术员培训规范：凡新入我科的病理技术员均需进行免疫组化理论知识的学习、培训，经考核合格、具备病理技术员技士资质后方能从事免疫组织化学染色。二、病理科免疫组织化学染色操作规范1.免疫组织化学染色前的准备事项(一)组织切片的制备常规切片脱蜡至水（组织固定需用10%中性甲醛）(二)抗体的选择、稀释和保存（1）选择抗体应先了解其反应谱和适用条件〔包括适用切片(石蜡切片抑或冷冻切片)、稀释度和温育时间等〕。（2）对于未曾使用过的新抗体，应按照有关说明书的提示，以几个不同的稀释度对适宜检材(已知阳性切片/涂片)进行预

2、试验;根据染色阳性表达的程度和检材背景着色程度，确定用于染色的最适稀释度（3）抗体的原液应于分装后置于一20℃冷室中保存，切勿反复冻存(以免效价降低)。（4）抗体的工作液可置于4℃冰箱中保存。（5）抗体的稀释。(1)一般用0.01MPBS(生理盐水磷酸盐缓冲液)，pH值7.2。(2)或用0.05MTBS(生理盐水三经基氨基甲烷缓冲液)，pH值7.6。(3)必要时可按需要加适量小牛血清清蛋白。(三)被检测组织内抗原的修复（1）经4%中性甲醛之类含醛基固定剂固定的组织，其切片中的抗原决定簇因醛的交联作用而被封闭，从而影响抗原一抗体反应。进行免疫组织化学染色前，对于组织切片

3、进行抗原修复处理，会使组织中的固有抗原尽量多地暴露出来，提升了大部分检测抗体的阳性率和反应强度。有的抗体不需要进行抗原修复。应按抗体试剂说明书的提示决定是否进行被检测组织内的抗原修复。（2）抗原修复缓冲液。(l)一般为0.01M柠檬酸缓冲液(2.1g柠檬酸溶于100ml蒸馏水中，用2MNaOH调节pH值至6.0)。(2)有些抗体需要特殊修复缓冲液，如高PH值的EDTA(50mMTris.，10mMEDTA，pH9.0)，或商品化的该高，10mMEDTA，pH9.0)，或商品化的该高pH修复液等。（3）抗原修复的常用方法。(l)胰蛋白酶消化法:①组织切片脱蜡、水化。②滴

4、加一滴0.1%胰蛋白酶液于组织切片上。③37℃下温育20-40min(温育时间取决于组织经4%中性甲醛固定时间的长短和被检测抗原)。④蒸馏水冲洗，终止反应。⑤阻断内源性过氧化物酶。⑥进行免疫组织化学染色。（配制0.1%胰蛋白酶液时，应将0.1g胰蛋白酶溶于0.1%无水氯化钙水溶液(pH值7.8)中。）（2)胃蛋白酶消化法:①组织切片脱蜡、水化.②滴加胃蛋白酶工作液于组织切片上。③37℃下温育10-30min(一般为10min，可延至30min，取决于组织经4%中性甲醛固定时间的长短).④浸人蒸馏水，终止反应。⑤进行免疫组织化学染色。用1%胰蛋白酶液37℃下处理20mi

5、n。(应以0.1MHCI配制胃蛋白酶工作液。过度的胃蛋白酶消化会使组织结构破坏、切片脱落。)（3)微波修复抗原法:①组织切片脱蜡、水化(硅化玻片或经防脱片胶处理的玻片)。②将组织切片置于容器(塑料盒或玻璃缸)中，并向其中加人抗原修复液200ml，盖上具有小孔的盖子。③将该容器置于微波炉(705-800W)中央加热(95℃)5min，2次(于两次之间，应向容器中添加蒸馏水50ml，严防组织切片干燥)。④将该容器移出微波炉，置于室温下冷却15-20min。⑤蒸馏水冲洗。⑥阻断内源性过氧化物酶，而后将切片置于蒸馏水中。⑦用TBS或PBS液冲洗。⑧进行免疫组织化学染色。(4)

6、热水浴法:①组织切片脱蜡、水化(硅化玻片或经防脱片胶处理的玻片)。②向装组织切片的容器加人足量(例如200ml)抗原缓冲液，置于水浴锅中，加热至95-99℃(不沸腾)预热。③将组织切片插人已预热的容器内，温育20-40min。④将该容器由微波炉移出，置于室温下冷却20min。⑤室温下，用TBS、PBS或水洗。⑥蒸馏水冲洗。⑦阻断内源性过氧化物酶，而后将切片置于蒸馏水中。⑧用TBS或PBS液冲洗。⑨进行免疫组织化学染色。（5)压力锅法:①组织切片脱蜡、水化(硅化玻片或经防脱片胶处理的玻片)。②向4-5.5L的不锈钢压力锅中加人抗原修复缓冲液(约为锅容积的2/3)，不加阀

7、情况下加热至沸腾。③将组织切片插放于金属切片架上，并置于压力锅内沸腾的缓冲液中。④加阀情况下，将组织切片加压2min。⑤压力锅自行冷却或以流水冷却减压后，持续20min。⑥将冷却后的切片取出，蒸馏水冲洗后，置于TBS或PBS液中(以免组织切片干燥)。⑦蒸馏水冲洗。⑧阻断内源性过氧化物酶，而后将切片置于蒸馏水中。⑨用TBS或PBS液冲洗。⑩进行免疫组织化学染色。（四）组织切片中内源性酶的阻断1.内源性过氧化物酶主要存在于红细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞了嗜酸性粒细胞和组织内。阻断方法:最常用0.3%-0.5%H2O2-甲醇液，作用15-30min，阻断液