时间分辨荧光免疫分析技术基本原理及应用

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1、时间分辨荧光免疫分析技术基本原理及应用上海新波生物技术有限公司标记免疫学发展历程10-18mole10-17mole10-15mole10-9mole10-12mole资料源自BIOTROLDIAGNOSTIC待测物质浓度与检测手段临床化学分析10-1210-910-610-310-0pg/mLng/mLmg/mLmg/mLg/L免疫分析TherapeuticDrugsThyroidHormoneFertilityHormoneAllergyCancerMarkersInfectiousDiseaseVitaminsSerumProteins常量微量超微量时间分辨荧

2、光免疫（TRFIA）（Time-ResoledFluoroimmunoassay）镧系元素标记技术＋免疫反应标记物具有独特物理特性的稀土金属---镧系元素镧系元素：共有15种，应用在时间分辨荧光免疫技术中有四种：铕(Eu)、钐（Sm)、镝(Dy)、锝(Te)原子标记利用荧光寿命极长的物理特性，通过时间延迟，将特异性荧光与非特异性荧光分辨开来，使本底达到0荧光寿命极长稀土元素螯合物（60~900us)<铕：714us>普通荧光免疫中荧光团：1~100ns样本中蛋白质荧光：1~10ns，易猝灭。利用稀土元素Stokes位移大的光谱特点，将发射光与激发光分辨开来，是0本底的又

3、一保障Stokes位移大（大约273nm）铕：激发光340nm、发射光613nm荧光素的Stokes位移为28~50nmEu螯合物荧光光谱300600400500波长nm荧光强度异硫氰酸荧光素发射光谱300600400500波长nm荧光强度激发光谱带较宽。激发光谱宽可增加激发能，提高灵敏度发射光谱很窄。发射光谱宽度∠10nm，利用615±5范围的滤光片，只允许此波段内发射光通过并被检测，排除其它波长的荧光，一方面降低了背景，另一方面使能量消耗减少，大大提高检测灵敏度。Eu螯合物荧光光谱300600400500波长nm荧光强度异硫氰酸荧光素发射光谱300600400500

4、波长nm荧光强度解离-增强技术使Eu荧光提高100万倍。相对提高Eu螯合物的比活性原因：在测定时，荧光物质可反复被激活。基态激发态激发光跃迁（DELFIA）比活性：单位时间内，每个标记分子的可探测事件的数目发射荧光（二）线性范围宽试剂时间分辨酶放大化学发光　直接化学发光AFP0.1-1000IU/ml0.2-300IU/ml1.0-1000IU/mCEA0.1-500ng/ml0.2-500ng/ml0.5-100ng/mlHCG0.5-10000U/L5-5000U/L2-1000U/LTSH0.005-100μU/ml0.002-75μU/ml0.03-150μU/

5、mlFSH0.05-256mU/ml0.1-170mU/m0.3-200mU/mlProg0.08-120nmol/L无0.1-40ng/mlProlactin0.04-250ng/ml0.5-150ng/ml0.3-200ng/ml以上数据均出自于各制造厂家自己的产品说明书（三）标准曲线稳定，试剂保质期长0.5125102050100200500U/L51002000Cps.103DELFIAHBsAgN=6时间分辨荧光免疫检测的标准曲线相当稳定，同一批次的试剂盒可用两点法加批次的参考曲线定标乙肝试剂稳定性实验结果（生检所报告）批号991215(20份标本）99122

6、0(20份标本）991225(20份标本）4℃（0-16月）37℃（0-9天）4℃（0-16月）37℃（0-9天）4℃（0-16月）37℃（0-9天）HBsAg0.5-3.6%1.56-3.9%1.25-3.0%1.0-3.6%0.76-3.2%0.75-4.3%HBsAb0.7-4.7%1.2-3.6%0.82-4.2%1.4-3.0%0.68-3.0%0.6-4.5%HBeAg1.5-2.5%0.6-3.1%1.3-4.5%1.6-4.2%1.5-3.9%1.1-3.6%HBeAb0.4-4.0%1.7-4.6%1.0-4.5%1.5-3.9%1.5-2.7%1.0

7、-4.9%HBcAb1.3-4.2%1.6-3.2%0.5-4.2%1.8-4.8%1.6-3.2%1.8-3.0%（四）重复性好同一标本连续20次检测，CV值∠2％。同一批（10个）标本连续3天检测，其CV值=2.9%。检测后反应板连续3天重复阅读，CV∠10％TRFIA检测HBsAg的重复性资料来源于上海长征医院新波公司乙肝试剂盒（TRFIA法)和国内XX公司乙肝试剂盒(EIA法)与进口MEIA乙肝试剂盒的结果比较方法新波公司（TRF法）国内XX公司(EIA法)灵敏度特异性灵敏度特异性HBsAg100%100%97.3%93.6%HB