实验二、细菌蛋白酶的发酵制备

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1、实验二、细菌蛋白酶的发酵制备一、实验目的原理了解气升式发酵罐的结构及特点，学会使用该类型的发酵罐培养微生物。本实验在5L发酵罐中进行细菌培养。通过测定菌体浓度了解细菌的生长规律，通过测定蛋白酶活力了解产物生成，分析菌体生长与产物生成的关系。同时检测发酵过程中的溶氧、pH等。二、材料与方法1.实验用培养基LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，卡那霉素5mg/L，pH7.4。0.5mg/mL抗生素溶液：称取0.05g卡那霉素溶于100ml无菌水。小管分装后置-20℃冻存备用。斜面培养基：配方同LB液体培养，调pH至7.4后

2、添加琼脂15g/L。三、实验过程1.种子制备250mL锥形瓶装培养基50mL，接种斜面菌种一环，于旋转摇床37℃培养12h转速150-200转/分。2.发酵前准1).清洗。发酵罐培养前后进行清洗（空气分布器、管内壁、顶板放零件的小间隙），外壁、底板、顶板擦干净。2).连接。进行发酵之前要对发酵系统（蒸汽发生器管路、空气压缩系统、冷却系统、发酵流加系统及在线控制系统）进行调试。主要工作是检查通气与通水管道的连接正确与否、管道是否破损、空压机能否正常工作、在线控制系统能否正常工作。发酵罐中配置用于供给冷却水、循环水及排水的管子。空压机空气供给的配管。连接

3、发酵罐、PH控制器、DO控制器等电源。注意不漏电和接错线。3).试剂。配置培养基、酸碱平衡液、消泡剂等。3.电极标定3.1pH电极标定pH电极零点和斜率要在进行灭菌以前进行，电极在使用前先用蒸馏水清洗并检查电极信号有无故障，然后再进行标定。一般而言如果发酵液偏酸性我们用6.86和4.00的缓冲液，如果偏碱性则配制6.86和9.18的缓冲液。点击控制器屏幕画面下方的“标定”，弹出标定菜单，选择相应罐（F1-F4）下的“pH电极”，弹出相应的pH电极标定界面。先进行零点标定，以酸性为例，将pH电极联好电极线用蒸馏水洗净后插入pH6.86的标准液中，点击“

4、零点值”，输入6.86，然后点击“开始”，待采样值完全稳定后点击“结束”。然后用蒸馏水清洗电极探测头后插入pH4.01的标准液中，同样方法输入斜率值4.01来标定斜率。接下来将PH电极插在发酵罐上与培养基一起进行灭菌，并用纱布和牛皮纸将电极的金属头包住，以免接触到水。实消后，冷却下来，连上电极线，接到灌上，这时PH电极将信号传给控制系统并显示发酵罐内发酵液的PH值。在发酵控制台上设定需要控制的PH，控制系统会通过流加酸碱控制PH。也可不控制PH，通过电极对发酵过程的PH变化进行检测。3.2溶氧电极的标定溶氧电极的零点要在灭菌以前标定，斜率必须在灭菌后

5、接种前，当温度等各项培养条件都满足发酵工艺的要求是进行标定。标定方法类似于pH电极的标定，点击控制器屏幕画面下方的“标定”，弹出标定菜单，选择相应罐（F1-F4）下的“溶氧电极”，弹出相应的溶氧电极标定界面。灭菌前先标定零点，标定液一般为饱和的无水亚硫酸钠溶液，输入零点值为1%，点击“开始”，待采样稳定后结束。在发酵罐实消之后，把通气、搅拌转速、温度等参数调整到设定值，待各参数稳定满足发酵条件后，进入相应罐的溶氧电极标定画面，输入斜率值100%进行斜率标定。使用时与PH电极一样，将溶氧电极装入发酵罐与培养基一起进行实消灭菌，并用纱布和牛皮纸将电极的金

6、属头包住，以免接触到水。实消完成后，待冷却后，连接电极线，连接到发酵罐的控制系统。4.实罐灭菌操作4.1.准备1）关紧发酵罐底阀，到入培养基，旋紧接种口。注：氯离子对不锈钢会带来不可逆转的破坏，因此应避免用盐酸溶液调节培养基pH，如工艺上无法避免加盐酸，应控制盐酸溶液浓度不大于5%且在添加过程中不得直接接触不锈钢。2）盖紧罐盖上各种盖帽（加酸、加碱、补料口等），旋紧罐盖压紧螺栓。3）标定好pH、DO电极，将电极插入罐体并及时的锁紧螺母，将电极的金属头用纱布+牛皮纸包裹好。4）关排气冷凝器进水阀，移去进出口的软管排尽冷凝水管中的水。5）盖上灭菌罐罩，旋

7、紧螺母。4.2.培养基预热1）准备工作本发酵罐是原位灭菌，要预先启动蒸汽发生器，空气压缩机（亦可稍后启动）确认控制器中的温度控制设定为手动。注：蒸汽发生器的使用方法①每次使用之前必须先打开排污阀和蒸汽阀，放掉炉内残余的污水。②排污后即可关闭排污阀。打开进水阀和电源开关，此时“低水位”灯亮并发出蜂鸣报警，水泵开始工作进行抽水（此时可打开水泵放气阀排除泵内多余空气），抽水结束后报警结束，“低水位”灯灭，蒸发器开始加热，“加热”灯亮。此时务必保证蒸汽阀处于关闭状态。压力表开始上升。③加热结束后即可正常使用热蒸汽。④每次使用完毕关闭电源后待压力降到1kg/c

8、m2以下时，都要打开排污阀排出管道内污水。2）开罐顶排气阀，开夹套排水阀排净夹套水，关闭其它阀门。3）蒸汽进