膜片钳技术讲座幻灯

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1、膜片钳技术讲座2002年11月20日第一部分膜片钳技术基本概念第二部分离子通道基本知识第一部分膜片钳技术的基本概念主要内容1.膜片钳技术简介2.膜片钳系统中的电位（电压）与电流3.膜片钳系统中的电阻4.膜片钳系统中的电容5.膜片钳系统中的串联电阻和电容补偿6.膜片钳系统中的漏减功能7.膜片钳系统中的信号滤波1976年德国马普生物物理化学研究所Neher和Sakmann首次在青蛙肌细胞上用双电极钳制膜电位的同时，记录到乙酰胆碱（Acetylcholine,ACh）激活的单通道离子电流，从而产生了膜片钳技术（patchclamptechniques）。1980年Si

2、gworth等获得10-100GΩ的高阻封接（Giga-seal），1981年Hamill和Neher等对该技术进行了改进，引进了全细胞记录技术，从而使该技术更趋完善，1983年10月，《Single-ChannelRecording》一书的问世，奠定了膜片钳技术的里程碑。1.膜片钳技术简介内尔(Neher)萨克曼(Sakmann)（1944-）（1942-）（德国细胞生理学家）（德国细胞生理学家）合作发明了膜片箝技术，并应用这一技术首次证实了细胞膜上存在离子通道。这一成果对于研究细胞功能的调控至关重要，可揭示神经系统、肌肉系统、心血管系统及糖尿病等多种疾病的发

3、病机理，并提供治疗的新途径。二人共获1991年诺贝尔奖。膜片钳记录技术创立以来，记录方式的变化经典记录模式：贴附式（Cell-attached或oncell)内膜向外式(Inside-out)外膜向外式(Outside-out)全细胞记录方式(Whole-cellrecording)发展记录模式：穿孔膜记录方式（Perforatedpatches）穿孔囊泡记录方式（Perforatedvesicles）高阻封接巨膜片记录方式（Gigaseal-Macropatch）松散封接记录方式(Loosepatchclamp)细胞内灌流记录方式(Intracellularp

4、erfusionpatch)巨大切割膜片钳记录方式（Giantexcisedpatches）使用的标本从肌细胞（心肌、平滑肌、骨骼肌）、神经元发展到卵母细胞、内分泌细胞、血细胞、肝细胞等其它多种细胞；从急性分散细胞和培养细胞（包括细胞株）发展到脑片或组织块乃至整体动物。从蜗牛、青蛙、蝾螈、爪蟾卵母细胞发展到大鼠、人等等。卵母细胞膜片钳技术、脑片膜片钳技术脑片膜片钳技术1．脑片撕裂法（Slicerendingmethod）（引自：Stuartetal.,1993）（引自：AscherP,1989）10μM10μMab（引自：TheAxonGuide》，1993。有

5、改动）2．表面清洁法（Surfacecleaning法）3.红外微分干涉相差显微镜法（IR-DIC法）4.盲法（Blind法）2.膜片钳系统中的电位（电压）与电流钳制电位（Holdingpotential,Vh）人为地将细胞膜内外电压差固定在某一数值，这一数值即为钳制电压或钳位电压。实施这一行为的技术为电压钳技术（Voltageclamp）。命令电压（Commandvoltage,Vcmp）通过放大器或计算机发出的电压指令，用于钳制细胞膜电位。电极电压降（Pipettevoltagedrop，Vp）由于有电极电阻（Rp）的存在，命令电压通过时就会产生电压降：Vp

6、=IRp，因此细胞接受的钳位电压为Vh=Vcmp-Vp。误差产生。而信号电压在被摄取时也会经过电极电阻，同样会产生电压降，产生误差。补偿方法：串联电阻的补偿。液界（接）电位（Liquidjunctionpotential）主要成分：1.液体--金属：Pt电极、AgCl电极与电极内液，又称电极电位；2.电极内液--细胞外液；3.电极内液--细胞内液（细胞较小、电极开口较大时，此值较小，破膜后，等待一定时间即可消除）。范围：可达几百mV。补偿方法：“Track”，“Offset”。浴液电位（Bathpotential,Vb）一般情况下，浴液通过参比电极接入工作地，所

7、有测量的电信号均为相对于此工作地的电位或电流。为真实地反映测量信号V，理论上要求Vb为0。V=Vtotal-Vb，Vb=IRb，V为测量信号，I为钳制电流。Vb的存在主要是因为浴液电阻Rb的存在。减小Rb就可降低Vb。要减小Rb就必须知道Rb的来源。Rb大体上有三个来源：1.细胞膜表面与参比电极之间的浴液通路电阻Ra=ρ/4πr(mm)，r为细胞半径。一般为几百Ω。2.琼脂盐桥电阻Ragar=ρL(cm)/S(cm2)，浴液与KCl液。长1cm，直径2mm的盐桥，Ragar=130Ω(KCl液),Ragar=2600Ω(Ringer液)3.参比电极电阻与接触面积

8、有关（越大越好），一般上