子宫内膜癌p16基因及蛋白表达

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1、子宫内膜癌p16基因及蛋白表达作者：陈桂黄,章兴凤,保芳,黄德年单位：1226500江苏如皋，如皋博爱医院妇产科　　2226500江苏如皋，如皋磨头中兴医院妇产科　3226001江苏南通，南通大学附属医院【关键词】子宫内膜癌p16基因蛋白表达子宫内膜癌是女性生殖系统的三大恶性肿瘤之一,近年来发病率呈上升趋势,威胁着妇女的身心健康。p16基因又称多肿瘤抑制基因,直接作用于细胞周期,抑制细胞分裂。研究表明,p16基因缺失、突变和甲基化与肿瘤的发生、发展有着密切的关系,预示着p16基因在肿瘤发生发展过程中有重要的作用。笔者采用RT-PCR及免疫组

2、化技术,分别对52例子宫内膜癌组织中p16基因及蛋白的表达进行了检测,探讨其与子宫内膜癌的关系。　　1资料与方法　　1.1一般资料收集2006年6月—2008年6月在我院及南通大学附属医院住院手术,术后病理证实为子宫内膜癌的标本52例。正常子宫内膜组织为全切除的良性子宫疾病，其中增生期内膜11例,分泌期内膜12例。切下的标本分两份，一份立即置液氮速冻后，保存于-80℃保存备用，另一份做常规病理及免疫组织化学检查。　　1.2器材TRIZOL及DEPC购自上海华舜生物工程有限公司。RT-PCR一步法试剂盒购自晶美生物工程公司，其中逆

3、转录酶AMVRT、Taq酶及dNTP均为FINNZYMES公司产品。ABC试剂盒为美国Vector公司产品,p16兔抗人多克隆抗体为SantaCruz公司产品。　　1.3引物设计与合成从GenBank查取基因序列，以Primer5软件设计p16及内参β-actin的引物各一对，其序列分别为，p16：上游5'-TCTGAGAAACCTCGGGAAAC-3'，下游5'-CGCAAGAAATGCCCACAT-3';β-actin：上游5'-AAGTACTCCGTGTGGATCGG-3'，下游5'-ATGCTATCACCTCCC

4、CTGTG-3'。扩增片段大小分别为307bp和495bp。上述引物均由上海生工生物技术服务有限公司合成。　　1.4RT-PCR实验常规TRIZOL法提取组织总RNA后，每管加入10×ReactionBuffer5μl，50mM/LMgCl21.5μl，10mM/L的dNTP1μl，RNA抑制剂1μl，10pmol/L的上下游引物各1μl，5u/μl的逆转录酶1μl，1u/μl的Taq酶2μl以及模板RNA1μg，最终加DEPC水至50μl。每对引物PCR的反应条

5、件均相同，即各扩增管先置于55℃水浴逆转录40min后，直接置PCR扩增仪94℃变性45s，54℃退火45s，72℃延伸60s，40个循环后，再72℃延伸5min。　　1.5常规病理及免疫组化检查标本经10%福尔马林固定,常规石蜡包埋,5μm连续切片,HE染色和免疫组化ABC方法染色。免疫组化以出现明显的棕色显色为阳性结果判断标准，切片中阳性细胞无或少于癌细胞总数的5%为阴性，阳性细胞占癌细胞总数的5%以上为阳性。　　1.6统计学处理采用两样本构成比(率)比较的χ2检验,当理论频数小于5时,以Fisher’s确切概

6、率法比较两样本构成比。　　2结果　　2.1p16基因表达结果p16及内参β-actin的RT-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后，其结果表明引物有较好的特异性，只有一条产物带，且其大小与预先设计的相一致，如图1。p16基因在52例癌组织中仅25例呈阳性表达，阳性率48.1%，而其在正常子宫内膜组织中均表达，两组间比较差异有显著性(P<0.01);而与正常子宫内膜组织中p16的表达差异同样有显著性，如表1。　　2.2p16蛋白表达结果23例正常子宫内膜组织标本中p16蛋白表达均呈阳性，阳性细胞分布较广，阳性染色表现为较为粗大的棕黄

7、或棕褐色颗粒分布于胞浆中。而子宫内膜癌组织中p16阳性染色明显减弱，52例子宫内膜癌组织标本中,p16蛋白的阳性表达率为42.3%(22/52),低于正常子宫内膜组织的100%,差异有显著性(P<0.01)。图1p16PCR产物电泳检测结果　　M：DNAmarker，1：仅β-actin表达，2：p16表达　　表1p16基因及蛋白在子宫内膜癌及正常组织中的表达注：与正常子宫内膜组织比，*P<0.01　　3讨论　　p16基因是1994年Kamb等[1]分离鉴定的一种新型抑癌基因，为细胞周期依赖性激酶(CDK)抑制蛋白，因

8、其对多种肿瘤有抑制作用而被命名为多肿瘤抑制基因。p16基因定位于人染色体9p21区域,全长8.5kb,由2个内含子及3个外显子构成,编码表达一个148个氨基酸残基的蛋白质。其功能