现代生物实验原理与技术考试整理

《现代生物实验原理与技术考试整理》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、蛋白质表达技术DNA重组表达：在合适表达元件（如转录启动子、终止子、翻译调控序列、转录酶、翻译因子等）调控下，目的基因表达成目的蛋白质的技术。外源基因在大肠杆菌中的表达：大肠杆菌表达外源基因的优势：1、全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架2、基因克隆表达系统成熟完善3、繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定4、被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物大肠杆菌表达外源基因的劣势：1、缺乏对真核生物蛋白质的复性功能2、缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统3、内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白4、细胞周质内含有种类繁多的内毒素大肠

2、杆菌表达载体分类：按蛋白质类型分：•单纯表达:pJLA系列,用NcoI/NdeI导入AUG的载体•融合表达:融合各种tag,GST,CBD,MAL,GFP,etc分泌表达:pel/ompT分泌肽按启动子分：lac及衍生的tac,trc,pac,rac等启动子IPTG诱导lamdaphagePL和PR启动子热诱导T7启动子IPTG诱导T5启动子IPTG诱导ara启动子阿拉伯糖诱导选择表达系统：1.蛋白质的大小：小的胞质蛋白和多肽最好能与运载序列连接，以融合蛋白的形式在大肠杆菌中表达。运载序列能起到稳定靶蛋白的作用，使其免受胞内蛋白酶的降

3、解，并能提供用于亲和纯化的配基结合位点。用蛋白酶在融合蛋白的适当位置进行切割，可以回收有活性的靶蛋白。2.蛋白质的需要量：如果需要少量的靶蛋白、酶的活性可以用粗提物来分析，一般不需要进行优化表达。3.蛋白质是否需要保留活性：（1）若只用于生产抗体，包涵体有利于分离。（2）若靶蛋白用于生物化学或细胞生物学研究，就要考虑活性，其次考虑纯化问题。（3）若要用于结构研究，最好能以可溶性状态表达。外源基因在大肠杆菌中的表达：外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理：转录：启动子、终止子、核糖体结合位点翻译：密码子、质粒拷贝数启动子：Lac表达系统以大

4、肠杆菌lac操纵子调控机理为基础设计、构建的表达系统转录调控机理：具有多顺反子结构，基因排列次序为：启动子（lacP）-操纵基因（lacO）-结构基因（lacZ-lacY-lacA）、正调节因子CAP、负调节因子lacI正调节因子CAP：cAMP激活CAP，CAP–cAMP复合物与lac操纵子上专一位点结合后，能促进RNA聚合酶与–35、–10序列的结合，进而促进Plac介导的转录。基因工程中使用的lac启动子均为抗葡萄糖代谢阻遏的突变型，即PlacUV5lacUV5突变体：PlacUV5突变体能够在没有CAP存在的情形下非常有效的起

5、始转录，受它控制的基因在转录水平上只受lacI的调控，因此用它构建的表达载体在使用时比野生型Plac更易操作。负调节因子lacI：在无诱导物情形下，lacI基因产物形成四聚体阻遏蛋白，与启动子下游的操纵基因紧密结合，阻止转录的起始。Trp表达系统：以大肠杆菌trp操纵子调控机理为基础设计、构建的表达系统转录调控机理：色氨酸启动子Ptrp受色氨酸-阻遏蛋白复合物的阻遏，转录呈基底状态。在培养系统中去除色氨酸或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA），便可有效地解除阻遏抑制作用。在正常的细菌培养体系中，除去色氨酸是困难的，因此基因工程中往往添加IA

6、A诱导Ptrp介导的目的基因表达Tac表达系统：tac启动子是由trp的–35序列和lacUV5的–10序列拼接而成的杂合启动子调控模式与lacUV5相似，但mRNA转录水平更高于trp和lacUV5启动子（Ptac=3Ptrp=11Plac），因此在要求有较高基因表达水平的情况下，选用tac启动子比用lacUV5启动子更优越。lac、tac启动子对宿主菌的要求：在普通大肠杆菌中，LacI阻遏蛋白仅能满足细胞染色体上lac操纵子转录调控的需要。当多拷贝的lacO随着带有lacUV5、tac启动子的表达质粒转化进入大肠杆菌后，LacI阻

7、遏蛋白与lacO的比例显著下降，无法保证每一个lacO都能获得足够的LacI阻遏蛋白参与转录调控。表现为在无诱导物存在的情形下，lacUV5、tac启动子有较高的本底转录。为了使以Lac、Tac表达系统具有严紧调控外源基因转录的能力，一种能产生过量的LacI阻遏蛋白的lacI基因的突变体lacIq被应用于表达系统。大肠杆菌JM109等菌株的基因型均为lacIq，常被选用为Lac、Tac表达系统的宿主菌。但是这些菌株也只能对低拷贝的表达载体实现严紧调控，在使用高拷贝复制子构建表达载体时，仍能观察到较高水平的本底转录。需在表达载体中插入l

8、acIq基因以保证有较多的LacI阻遏蛋白产生。lac、tac表达系统存在的问题：IPTG用于诱导lac、tac启动子的转录，但由于IPTG本身具有一定的毒性。从安全角度，对表达和制备用于医疗目的的重组蛋白并不适合。一些