重组孕激素受体基因酵母法对南山茶子拮抗孕激素作用的研究论文

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1、重组孕激素受体基因酵母法对南山茶子拮抗孕激素作用的研究论文吴小娟，李剑，刘芸，李娜，唐玲，冯宝民，王永奇【摘要】目的研究南山茶子拮抗孕激素作用。方法用系统溶剂分离法将南山茶子醇提物分成极性不同的组分，利用重组人孕激素受体基因酵母生物检测法筛选南山茶子拮抗孕激素活性部位。结果5个组分都表现出拮抗孕激素的效应.freelelliaserrdserrateChi.MethodsTheseedsofCamelliaserrdserrateChi.extractalbutylalcoholpetroleumetherelliaserrdserrateChi.

2、.KeyelliaserrdserrateChi.;Rebinantyeast;Progesteronereceptor;Antagonisticeffect正常人骨代谢的平衡是离不开体内一种特殊物质调节的，这种特殊物质就是激素。激素是由内分泌器官所分泌的一种高效能有机化合物，人体内很多种激素，其中目前已经明确与骨质疏松有关联的8种：雌激素、甲状腺激素（PTH）、降钙素、活性维生素D、甲状腺激素、雄激素、皮质类固醇激素、生长激素。其中前4种更为重要。这些激素或通过影响破骨细胞的数量及活性来调节骨吸收过程，或通过影响成骨细胞的活性来调节骨形成过程，从

3、而调节骨代谢。当这些激素在人体内达到某一浓度时能够维持骨吸收与骨形成的平衡，但当它们在体内的含量发生异常变化时，便会使骨代谢失去平衡，导致骨量的减少，从而引起骨质疏松。已有大量的文献报道［1，2］：孕激素受体能够降低雌激素受体(ER)的转录活性，也就是说对孕激素受体活性的抑制能够增强体内雌激素受体活性的表达。南山茶CamelliaserrdserrateChi.属于山茶科山茶属植物，广泛分布于我国的西南部和东南部，集中分布于我国长江以南的亚热带地区，资源非常丰富［3］，其化学成分主要有黄酮，皂苷和多酚这三大类［4］，我们在对山茶属植物药用价值的研究

4、过程中发现，南山茶种子乙醇提取物对维甲酸所致骨质疏松的大鼠有很强的抗骨质疏松活性，并且明显高于阳性对照药。为了具体确定南山茶子抗骨质疏松的有效部位，我们首先用95%乙醇提取南山茶子得到醇提物，对其中三类化学成分的含量进行了测定，总黄酮4.07%，总皂苷12.15%，总酚4.30%［5］，并分别依次用石油醚、醋酸乙酯、水饱和正丁醇进行萃取，浓缩至干，再用转基因酵母的生物检测方法对它们是否有拮抗孕激素受体的作用进行研究，从而从另一角度来阐明南山茶子抗骨质疏松的作用机理。1仪器与试药Laborata4000型旋转蒸发仪（Heidolph，Germany）

5、；酶标仪（SpectraFluorplus，TECAN，Austria）；分光光度计（S2，广州IKAP.Biomedical公司）；酶反应底物邻硝基苯基β－D－半乳糖苷（Sigma）；二甲基亚枫(Sigma)，所用试剂均为分析纯，溶于超纯水（Milli-Q，USA）。2方法2.1试剂的配制2.1.1SC培养液称取36mg赖氨酸，12mg组氨酸，6.7g无氨基酵母氮源，20g葡萄糖溶于1000ml超纯水中，用0.22μm滤膜过滤除菌后于4℃下冷藏保存。2.1.2基础缓冲液称取21.5gNa2HPO4·12H2O，6.22gNaH2PO4·2H2O，

6、0.75gKCl，0.25gMgSO4·7H2O溶于1000ml超纯水中，于4℃下冷藏保存。2.1.3邻硝基苯基β－D－半乳糖苷溶液（ONPG）溶液（13.3mmol·L-1）称取0.4gONPG溶于100ml基础缓冲液中即可（现配现用）。2.1.4Na2CO3溶液（1mol·L-1）称取10.6g无水Na2CO3溶于100ml超纯水中，于4℃下冷藏保存。2.1.5CuSO4溶液（50μmol·L-1）称取1.196gCuSO4·5H2O溶于100ml超纯水中，于4℃下冷藏保存。2.2酵母接种的培养重组人孕激素受体基因酵母由Gaido赠送，培养基为

7、增加硫酸铜（50μmol·L-1）、腺嘌啉、赖氨酸、色氨酸的SC培养基，室温避光保存［6］。将1ml新鲜冻融的酵母菌株接种到9mlSC培养液中加10μlCuSO4，置于转速130r·min-1，温度为37℃的空气浴摇床中培养过夜，用分光光度计测定10倍稀释的酵母菌株培养液在600nm波长处的吸光度（以培养基为空白），要求吸光度值在0.15～0.5，用培养液将酵母菌液稀释到A600=0.75作为工作液［7］。2.3南山茶的抗孕激素活性测定分别称取南山茶子醇提物，石油醚层浸膏，醋酸乙酯层浸膏，正丁醇层浸膏以及水层浸膏各50mg，用1mlDMSO溶解，得

8、浓度为50mg·ml-1的溶液。取990μl工作菌液至对应的EP管中，分别加入5μlDMSO（空白），5μl用DMSO溶解