生物信息学论文 胡小鹏

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1、深圳大学考试答题纸(以论文、报告等形式考核专用)二○一一～二○一二学年度第2学期课程编号23222005课程名称生物信息学主讲教师苏庆宁李凌云买制刚评分学号姓名专业年级2012级生物医学工程（医）教师评语：题目：小鼠肿瘤坏死因子α启动子荧光素酶表达载体的构建摘要：利用NCBIgenebank数据库及genetool软件设计引物，克隆小鼠TNF-α启动子序列，将其插入荧光素酶表达载体pGL3-basic中。将经过鉴定的重组载体pGL3-TNFα-promoter转染巨噬细胞264.7，应用萤光素酶

2、检测系统检测其活性。1.查找启动子序列：打开NCBI的Mapviewer网站，网址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/index.html，输入要查询的TNF-α，得如下结果：再点击右下方quickfilter勾上gene选项，找到TNF-alpha基因所在染色体上的位置：点击17号染色体上的Genesseq（注：下边的几个序列也是一样的，一般选第一个即可）出现如下信息：点击，Download/ViewSequence/Evidence，查看基因序列：Sequ

3、enceFormat选择Genebank形式，再点击Display,出现：目的基因的相关序列以及信息。可知转录位点从基因1956位开始转录，由于内含子的存在，所以mRNA在DNA上序列上分成了几段。promoter位于转录起始位点上游约2000bp区域，启动子序列为：2.引物设计用NCBI查出小鼠TNF-α的基因的CDS：打开网站：http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php，查询在这段开放阅读框内0cutter的酶，并结合结合实际情况，使用列表中的XhoⅠ

4、、HindIII作为引物酶。用genetool软件设计引物：ForwardPrimerName:TNF-αdeg1-21Len:21Score:76*PredictedMeltingTemperature:58degreesCelsiusGeneToolScore:76Start:1End:21Length:21Bases:5'CCAATTCTCGAGGTTTTCCGAGGGTTGAAT3'ReversePrimerName:TNF-αdeg1934-1956Len:23Score:74*Pre

5、dictedMeltingTemperature:51degreesCelsiusGeneToolScore:74Start:1934End:1956Length:23Bases:5'CCATAAAGCTTGAGGGAGATGTGGCGCCT3'上游引物P15'端加入XhoⅠ酶切位点（CTCGAG）即5'CTCGAGCCCAATTCTCGAGGTTTTCCGAGGGTTGAAT3'下游引物P25'端加入HindIII酶切位点（AAGCTT）即5'AAGCTTCCATAAAGCTTGAGGGAGA

6、TGTGGCGCCT3'请外面引物公司合成，扩增基因片段长度为：233bp。2.基因组DNA提取按组织/细胞基因组DNA快速提取试剂盒说明提取小鼠基因组DNA。-20℃保存备用。3.目的片段的扩增以基因组DNA为模板，用上游和下游引物扩增TNF-α启动子DNA序列。用genetool软件模拟电泳结果：MWM:DNAmarker1:PCR产物，大小为233bp图1。TNF-α启动子序列PCR产物5.TNF-α启动子荧光素酶表达载体的构建及鉴定回收产物的电泳条带，用试剂盒对PCR产物进行纯化。Xho

7、Ⅰ和HindⅢ分别双酶切扩增的TN-Fα启动子和载体pGL3–basic，琼脂糖凝胶分离酶切产物，AXYGEN胶回收试剂盒回收和纯化目的片段。T4DNA连接酶连接pGL3-basic和TNF-α片段过夜，转化感受态细菌JM109，接种含IPTG和X-gal的Amp+LB培养皿培养。取阳性克隆菌酶切、测序。重组体命名为pGL3-TNFα-promoter。用genetool软件模拟双酶切电泳结果：MWM:DNAmarker1:重组质粒pGL3-TNFα-promoter图2.限制性内切酶双酶切图6

8、.基因测序结果：7.转染及荧光素酶活性检测实验组将pGL3-TNFα-promoter+pRL-SV40（转染效率内参），对照组pGL3-basic+pRL-SV40分别用脂质体Lipofectamine2000瞬时转染巨噬细胞264.7。实验组、对照组各24孔。转染36h后，按照双荧光素酶检测试剂盒（DualLuciferaseAssaySystem）的操作说明处理转染细胞，并通过GloMax20/20发光检测仪测萤火虫荧光素酶及海肾荧光素酶的荧光值，将两者的比值，作为衡量荧光素酶活性的依据。