限制性内切酶酶切位点保护碱基

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1、寡核苷酸近末端位点的酶切(CleavageClosetotheEndofDNAFragments(oligonucleotides))为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260单位的寡核苷酸。取1µg已标记了的寡核苷酸与2

2、0单位的内切酶，在20°C条件下分别反应2小时和20小时。反应缓冲液含70mMTris-HCl(pH7.6),10mMMgCl2,5mMDTT及适量的NaCl或KCl（视酶的具体要求而定）。20%的PAGE（7M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。DNA合成，新链的延伸方向是5→3因此，需要在5端加上酶切位点,因为内切酶除了有特异的识别位点之外，还需多几个无需特异性的碱基提供一个platform让它可以结合上去，否则会掉下来.引物的结构就是（5→3）：保护碱基+酶

3、切位点+原来的引物序列首先要看目的基因中是否含有该酶切位点，只有没有的才可以选(小虾米酶切位点分析)。其次，如果需要做表达，需要考虑起始密码子，防止移码突变酶寡核苷酸序列链长切割率%2hr20hrAccIGGTCGACCCGGTCGACCGCCGGTCGACCGG81012000000AflIIICACATGTGCCACATGTGGCCCACATGTGGG810120>90>900>90>90AscIGGCGCGCCAGGCGCGCCTTTGGCGCGCCAA81012>90>90>90>90>90>90AvaICCCCGGGGCCCCCGGGGGTCCCCCGGGGGA

4、8101250>90>90>90>90>90BamHICGGATCCGCGGGATCCCGCGCGGATCCGCG8101210>90>9025>90>90BglIICAGATCTGGAAGATCTTCGGAAGATCTTCC81012075250>90>90BssHIIGGCGCGCCAGGCGCGCCTTTGGCGCGCCAA81012005000>90BstEIIGGGT(A/T)ACCC9010BstXIAACTGCAGAACCAATGCATTGGAAAACTGCAGCCAATGCATTGGAACTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT222427025

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7、AAATAAGAATGCGGCCGCTAAACTATAAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAA12162024280101025250101090>90NsiITGCATGCATGCACCAATGCATTGGTTCTGCAGTT122210>90>90>90PacITTAATTAAGTTAATTAACCCTTAATTAAGG81012000025>90PmeIGTTTAAACGGTTTAAACCGGGTTTAAACCCAGCTTTGTTTAAACGGCGCGCCGG81012240007502550>90PstI