黄芪对糖尿病足溃疡处成纤维细胞透明质酸合成酶mrna及透明质酸影响

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1、黄芪对糖尿病足溃疡处成纤维细胞透明质酸合成酶mRNA及透明质酸影响摘要　目的：探讨黄芪对糖尿病足溃疡处成纤维细胞透明质酸合酶mRNA及透明质酸的影响。方法：用含／未含黄芪的培养液培养糖尿病足溃疡处成纤维细胞，RT―PCR检测透明质酸合酶mRNA表达，放免法检测培养上清液中透明质酸含量。结果：用含黄芪的培养液培养的糖尿病足溃疡处成纤维细胞透明质酸合酶mRN表达及培养上清液中透明质酸含量高于未含黄芪的培养液培养的细胞，且差异有统计学意义(P＜0．05)。结论：黄芪能上调糖尿病足溃疡处成纤维细胞透明质酸合酶mRNA表达和促进透明质酸的合成。关键词　黄芪糖尿病足成纤维细胞透明质酸合酶透明质酸正常伤口

2、的修复包括炎症、增生和修复三个阶段，在伤口愈合过程中，稳定细胞和不稳定细胞都具有完全的再生能力，但能否重新构建为正常结构尚依赖细胞外基质，透明质酸作为细胞外基质的主要成分，主要由成纤维细胞分泌[1]；本实验体外用黄芪作用糖尿病足溃疡处成纤维细胞，通过检测成纤维细胞透明质酸合酶mRNA表达及透明质酸的分泌量，旨在探讨黄芪对糖尿病足溃疡处成纤维细胞功能的影响。1　材料和方法71．1材料与主要试剂黄芪注射液(成都地奥公司)，TRizolReagentTotalRNAlsolationReagent(GiBco公司)，cDNA第一链合成Kit(上海生物工程公司)、dNTP、TagDNA聚合酶、引物合

3、成(上海生物工程公司)，DE-PC、DNAmarker(华美生物公司)，胎牛血清(四季清公司)，异丙醇等常用化学试剂(Sigma公司或国产分析纯)；透明质酸放射免疫检测试剂盒(上海海研所)。透明质酸合酶引物正／负链序列：5’AAACCGCTCGAA―CAAGTC3和5’AACCCTGALGC-CAATCAAA3’，GAPDH引物正／负链序列：5’TGCTTTCCGTCG―TATCCA3’和5’CACCGTCAGTAGC―CCAGT3’，扩增片段大小分别为175和221bp。1．2方法1．2．1成纤维细胞培养取溃疡创面组织，经0．01mg／L新洁尔灭浸泡10min后生理盐水漂洗，剪成1mm3大

4、小，贴壁2h后将组织块培养于含100ml／L胎牛血清的DMEM培养基中，培养条件为37℃，体积分数为5％CO2，细胞生长至对数生长期后，将细胞悬液调整至1×107／L，移入24孔板中培养，待细胞贴壁后用含／未含20g／L黄芪的培养液进行培养，待瓶底长满细胞后，以2．5mg／L胰酶消化传代，培养6天后，收集细胞作相应检测。1．2．2半定量RT―PCR检测透明质酸合酶mRNA表达　细胞RNA的提取按TRizol7Reagent试剂盒说明书进行；用cDNA第一链合成Kit将RNA逆转录为cD―NA，按试剂盒说明书进行；半定量PCR反应扩增透明质酸合酶mRNA：PCR反应体系(50μl)：10×PC

5、RBuffer(5．0μl)，25mMMgCl2(3．0μl)，4×dNTP(3．0μl)，透明质酸合酶20uM引物正链(1．5μl)，20uM引物负链(1．5μl)，②GAPDH20uM引物正链(0．75μl)，20uM引物负链(0．75μl)，cDNA(2．0μl)，5U／μlTag(0．8μl)，H2O(33．2μl)。半定量RT―PCR反应(同一管内进行)；PCR反应条件：透明质酸合酶mRNA扩增：先加透明质酸合酶引物(1．5μl+1．5μl)，95℃预变性5min，94℃变性1min，50℃退火50s，72℃延伸1min，15cycle；GAPDH加入：取上述产品加GAPDH引物(

6、0．75μl+0．75μl)，94℃变性1min，50℃退火50s，72℃延伸1min，15cycle；PCR产物各取10μl用1．5g／L琼脂糖凝胶进行电泳，EB染色观察。一次性成像系统照相，各条带的光密度值用彩色图像摄录输入仪(型号：JVCky―F30B3―CCD)输入，德国KONTRONLBAS2．0全自动图像分析系统进行分析，分析结果用透明质酸合酶／GAPDH计算得到透明质酸合酶mRNA表达的半定量结果。1．2．3体外合成透明质酸含量的测定留取用含／未含20g／L黄芪的培养液进行细胞培养后每次换液的上清液，用全自动γ计数仪检测透明质酸含量，操作按试剂盒说明书进行。71．3统计学方法计

7、量资料用x±s表示，差异比较采用配对t检验。2结果含／未含黄芪的培养液培养后的成纤维细胞透明质酸合成酶mRNA表达RT―PCR结果分析，将用含／未含黄芪的培养液培养后的成纤维细胞mRNA与内参照GAPDH于同一条件下同时扩增，其扩增产物强度经电泳后图象分析，结果表明，用含黄芪的培养液进行培养后的成纤维细胞透明质酸合成酶mRNA表达均明显高于未含黄芪的培养液进行培养后的成纤维细胞的表达，结果经t检验比较，差异有