天然高产脂肪酶细菌的分离鉴定及脂肪酶基因的分析论文

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1、天然高产脂肪酶细菌的分离鉴定及脂肪酶基因的分析论文张迎光，施晓聪，林全思，王震，吕建新【摘要】目的：从环境中分离高产脂肪酶的细菌，并克隆其脂肪酶基因。方法：从天然高油脂含量土壤筛选高产脂肪酶的细菌，鉴定菌种后，设计相应引物PCR扩增脂肪酶基因并进行TA克隆.freelenvironment，andcloneitslipasegene.Methods:HighactivitieslipaseproducingbacteriasoilplifiedlipasegeneidedintoE.ColiDH5αtobuildtheengineeringbacteria.

2、Atlast，thelipasegeneplifiedbyPCR，thenseparatedandidentifiedasaneutantlipasegenebyrestrictionendonucleasedigestingandsequencing.standardlipasegeneregisteredonNCBI(EU310372)，Thesecondarystructureoftheneutantlipasegeneoredifferentfromstandardlipase.Conclusion:Astrainofhighactivitiesli

3、paseproducingbacteria-Staphylococcusaureusissuccessfullyisolatedandtheclonedlipasegeneisaneutanttype.KeyidPurificationKitVer.2.0）、基因组提取试剂盒，均购自宝生物工程有限公司；橄榄油、聚乙烯醇（PVA）、溴甲酚紫购自上海三爱思试剂有限公司。1.2产脂肪酶天然菌株的筛选及鉴定产脂肪酶细菌主要从自然界中筛选，采集温州汽车站，茶山镇及温州医学院茶山校区周围的油污丰富的土壤，供分离使用。共采集到土壤样品14份(包括:河道污泥、餐厅厨房清洗处

4、污泥、菜市场肉案上木屑、修车店门前污泥、饮食店油烟机油渍等)。筛选方法是：样品经富集培养、平板初筛(观察变色圈大小)，最后经摇瓶复筛(测酶活力大小)，具体的配方及操作参照文献9。将分离到的菌株用法国梅里埃微生物鉴定仪鉴定，然后进行酶活测定。1.3天然菌基因组提取的优化运用了试剂盒法、酚-氯仿法、煮沸法三种方法分别提取金黄色葡萄球菌全基因组，并经PCR扩增脂肪酶基因10，比较三种方法的优缺点，为后续实验提供一定的基础。1.4脂肪酶基因的克隆根据NCBI上公布的一些常见的细菌脂肪酶基因设计了8对通用引物（见表1）。用8对引物分别对分离出的菌株进行脂肪酶基因的扩增

5、。PCR反应条件I为：94℃预变性5min，再循环30次：94℃变性55s，58℃退火50s，72℃延伸150s，最后1个循环72℃延伸10min，适用于引物3、5、8的扩增。PCR反应条件II为：94℃预变性5min，再循环30次：94℃变性55s，58℃退火50s，72℃延伸1min，最后1个循环72℃延伸10min，适用于引物1、2、4、6、7的扩增。PCR反应体系为50μL体系。PCR产物用经试剂盒纯化，用T4连接酶于与pMD18-TVector，16℃连接2h后，转化感受态E.coliDH5α细菌，再将少许菌液涂布在含有X-Gal，IPTG，Amp

6、的L-琼脂平板培养基上培养，进行蓝白斑筛选验证试验。1.5pMD18-TVector重组载体鉴定挑取上步骤中单个白色菌落扩大培养，提取质粒11，双酶切电泳鉴定。同时将单个白色菌落的菌液送上海生工测序。1.6脂肪酶测序分析及二级结构预测分析运用软件CodonCodeAligner分析测序结果，SPSS11.0统计学软件对其进行统计分析，通过在线软件PredictProtein分别对人工分离到的金葡菌脂肪酶和NCBI上注册号EU310372脂肪酶进行二级结构预测分析12。2结果2.1产脂肪酶天然菌株的筛选经过初筛、复筛培养，分离出4株活性较高菌株，经过法国梅里埃

7、微生物鉴定仪鉴定，2株为霉菌，1株为适应弱碱性环境的金黄色葡萄球菌（见图1A，1B），1株为蜡样芽孢杆菌。经过富集、初筛、复筛等过程，用溴甲酚紫平板从富含油脂的土壤中筛选得到产脂肪酶的菌株，大部分酶活力经测定后在20U/mL以内（见表2）。并对其中的4株的酶学特性做了初步研究，4株的作用温度都较高，在42℃左右，一株为产弱碱性脂肪酶，另3株为产弱酸性脂肪酶。2.2天然菌基因组提取的优化所提供的三种提取方法提取全基因，提取效果见图2。泳道1和3试剂盒法、酚-氯仿法所提取DNA电泳条带清晰，泳道2煮沸法提取DNA电泳条带几不可见，表明试剂盒法、酚-氯仿法方法提取

8、的DNA得率较高，煮沸法提取的DNA得率较低。2.2