第四章酶联免疫测定法

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1、第四章酶联免疫测定法经典的化学分析方法（滴定分析、重量分析、简单的吸光光度法）是以简单离子或分子为检测对象的常量或微量分析，面对生物体系成分复杂且待测物浓度较低的测试条件则往往无能为力。于是，一系列针对生物体系中化学成分的测量方法应运而生。免疫化学分析即其重要成员，它将免疫学知识与化学分析手段有机结合，为生命体系中高特异性、超微量的分析提供了解决方法。基本概念：抗原：抗原是指进入人或动物机体后，可刺激机体免疫系统发生免疫应答，从而引起动物产生抗体或形成致敏淋巴细胞，并能和抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质。抗体：是由抗原刺激动物的免疫系统后，由免疫系统产生分泌的能和相应抗原发生特异

2、性结合的免疫球蛋白。1.1抗原抗体反应的基本特性：1.1.1可逆性抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为：Ag+Ab→Ag·Ab高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不易解离。解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性。1.1.2特异性抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。1.1.3最适比例1.1.4敏感性化学比色法的敏感度为mg/ml水平酶反应测定法的敏感度约为5-10μg/ml标记的免疫敏感度可提高数千倍，达ng/ml水

3、平例如，HBsAg，其敏感度可达0.1ng/ml。第一章概述1标记免疫技术：将试剂抗原或试剂抗体用可以微量检测的标记物（例如放射性核素、荧光素、酶等）进行标记，试剂与标本中相应的抗体或抗原反应后，不必测定抗原抗体复合物本身，而是测定复合物中的标记物，这种免疫技术，称为标记免疫技术.2标记免疫技术的分类：⑴按标记物分类：同位素标记荧光素酶标记等等放射免疫技术发光免疫技术酶免疫技术三大经典标记技术三大经典标记技术放射免疫技术放射免疫技术是利用放射性核素的可探测的灵敏性、精确性，抗原抗体反应的特异性组合而创建的一类免疫测定技术医学生物学超微量分析的里程碑。放射免疫技术分为：放射免疫分析免疫放

4、射分析放射免疫分析的测定原理Ag+AbAg–Ab+Ag（待测品）Ag–AbRR将标记抗原（Ag*）和未标记抗原（Ag）与特异性抗体（Ab）相混合，结果形成标记的和未标记的抗原抗体复合物。标记和未标记的抗原竞争与抗体进行结合的现象，成为竞争性抑制作用。Ab限量，Ag*定量,Ag*和Ag的量大于Ab结合位点，二者通过竞争方式与Ab结合；随着Ag增加，Ag*与Ab结合形成Ag*Ab复合物的放射量降低,二者变化成函数关系。放射免疫技术的应用放射免疫技术的特异性强、精密度好，灵敏度高（10-9-10-15g/L），对半抗原和抗原的测定及仪器设备条件要求不高，是基层医院测定超微量物质的主要手段，常

5、用于各种激素、微量白蛋白、肿瘤标记物和药物等微量物质的检测。放射免疫技术的缺陷放射性核素半衰期短，试剂有效期短，通常为一个月。由于标记物的不断变化，使试剂批间、批内差异大，标准曲线无法保存备用。放射免疫使用放射性核素标记，需要一定的防护及废物处理措施。结果测定依靠时间的累计，至少每一样本一分钟。无法进行自动化分析第二节酶联免疫法免疫酶技术：酶标记试剂制备容易、稳定、有效期长，免疫酶技术的敏感性接近放射免疫试验，可直接肉眼观察也可借助简单的仪器作定量测定，所得结果比较客观。一、酶免疫测定法的概念和分类把抗原抗体的免疫反应和酶的高效催化作用原理有机地结合起来。将酶与抗体或抗原用交联剂结合起

6、来，形成酶标抗体或抗原。这种抗原或抗体与体内或者固相上的抗体或抗原特异性结合，加入相应的酶底物时，底物被酶催化生成有色产物，根据呈色深浅来判断待测抗原或抗体的活性和浓度。酶免疫技术酶免疫组化酶免疫测定均相非均相固相酶免疫测定液相酶免疫测定组织切片或其它标本中抗原的定位液体标本中抗原或抗体的定性和定量均相法：不需分离复合物与游离标记物即可直接测定的方法。异相法则需分离后测定1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者VanWeerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法(enzyme-linkedimmuno

7、sorbentassay,ELISA)。ELISA现在已成为目前分析化学领域中的前沿课题，它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶技术(immunoenzymatictechniques)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。ELISA的基本原理和方法ELISA的种类和变化ELISA的特点ELISA的应用实例ELISAELISA的基本原理有三条：（1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并