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1、探讨微生态制剂对断奶仔兔肠道免疫功能的作用 断奶仔兔的生长发育尚未完全,抵抗外界环境的调节机能较差,容易产生腹泻、腹胀和球虫等疾病,降低了日增重和饲料报酬,发病率和死亡率增加.饲养者往往通过添加抗生素来增强仔兔的抗病力,而抗生素在预防和治疗家兔疾病上的滥用现象,常常引起细菌耐药性的产生和肠道菌群紊乱,造成二次感染.微生态制剂以其无污染、无残留、安全可靠、不产生抗药性等优点广泛应用于畜牧业.研究者发现,饲喂微生态制剂可以调节仔鹅盲肠微生态菌群,提高机体免疫力和生长性能,同时增强断奶仔兔的抗病力,降低料肉比,减少腹泻率,提高断奶仔兔的生产性
2、能. 1997年变性梯度凝胶电泳技术(DGGE)首次应用于微生物生态学研究,并证实该技术在研究自然界微生物群落遗传多样性和种群差异方面具有显着优越性.在畜牧业养殖中,DGGE逐渐应用于牛、羊、猪和鸡等动物肠道菌群多态性和系统发育关系的研究,在兔肠道的研究中应用还较少. 白秀娟等(2012)研究结果表明,PCR-DGGE完全可以用于断奶后仔兔肠道菌群结构的研究,从而弥补了传统微生物分离培养方法费时费力和精确度差的缺陷.本文旨在通过测定添加微生态制剂后回肠SIgA的分泌量,探讨微生态制剂对断奶仔兔肠道免疫功能的作用,并从分子水平探讨肠道菌
3、群的变化,为其在畜牧业中应用提供参考. 1材料与方法 1.1材料 肽菌素:购自山东宝来利来生物工程股份有限公司,主要由高活性抑菌型枯草芽孢杆菌、乳酸菌及其代谢产物抗菌肽组成,活菌总数≥1.5108cfu/g. 常康泰:购自山东宝来利来生物工程股份有限公司,主要由高效抑菌型芽孢杆菌、乳酸菌、细菌素、抗菌肽及肠道修复因子组成,活菌总数≥3.0108cfu/g. 布恩氏固定液、苏木精和伊红染色液:由山东宝来利来生物工程股份有限公司生物研究院实验室自制. SIgA检测试剂盒:购自普天试剂公司. 粪便基因组提取试剂、PCR
4、扩增试剂:购自TIANGEN公司. 实验设备:切片机、酶标仪、PCR仪、DGGE电泳仪(Bio-Rad)、脱色摇床. 1.2试验设计与日粮组成 试验采用单因子完全随机区组设计,选用刚断奶仔兔120只,平均体重为513g.随机分为4组,每组3个重复,每个重复10只兔.对照组饲喂基础日粮(参考正常兔料营养标准),试验1~3组分别在基础日粮的基础上添加肽菌素(120g/t)、复合肽菌素(120g/t)和锌酵母(150g/t)以及常康泰(500g/t).基础日粮根据当地肉兔的营养水平配制,日粮组成及营养水平见表1. 1.3饲养管理
5、断奶仔兔采用笼养方式,每笼2~3只.试验期间仅提供颗粒料,不饲喂其他精青粗饲料.每天早晚定时喂料,自由采食、饮水.搞好兔舍卫生工作,保证兔舍温暖、干燥、清洁,统一免疫和驱虫. 1.4样品采集 试验期结束后,将各组兔处死后解剖,取一段回肠,冲洗干净后于10%的福尔马林溶液中固定用于观察小肠绒毛,另取一段回肠(连同内容物)-80℃保存,用于测定SIgA的表达量,最后取盲肠内容物,将每组每个重复内10只兔的盲肠粪便做等份混合,即每个组有3个盲肠粪便样品,再将这3个样品做等份混合形成第4个样品,即每组有4个样品用于检测微生物菌群的变化. 1
6、.5测定指标及方法 1.5.1兔回肠绒毛观察 截取一小段兔回肠包埋在石蜡中,使用切片机横向切片后脱蜡,布恩氏固定液固定5min后乙醇洗涤,苏木精、伊红染色各30min,最后用加拿大树胶封片.置45℃温箱中烘烤过夜后进行镜检. 1.5.2兔回肠SIgA抗体水平的测定 准确截取1cm肠段,用剪刀纵向剖开.加入5mLPBS缓冲液,漩涡震荡1min.8000r/min离心5min,取上清液,移入新的离心管.取的上清液12000r/min离心10min后取上清液为待测样品,用ELISA试剂盒检测. 1.5.3兔肠道菌群结构的变化 每个试
7、验组称取粪便样本180~220mg至干净的2mL离心管,离心管置于冰盒上.按照粪便基因组提取试剂盒说明书的步骤提取兔粪便总DNA.以提取的DNA直接作为PCR模板,采用细菌16SrRNA基因V3区通用引物对:GC-357F(5'-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3')和517R(5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'),引物由上海生工合成.PCR反应体系25μL:2Taqmix12.5μL,上、下游引物(
8、10umol/L)各1μL,模板DNA1μL,无菌双蒸水9.5μL.PCR反应程序为:94℃预变性4min;94℃变性1min,65℃退火45s,退火温度每个循环降低0.5℃
