运用基因芯片数据库发掘玉米内参基因

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1、运用基因芯片数据库发掘玉米内参基因第一部分文献综述1.1基因芯片研究进展人类基因组测序完成之后，生物学进入了基因组和蛋白质组时代，研究人员迫切希望找到能实现大规模功能基因挖掘的技术，替以往的电泳、杂交等传统方法。随着测序技术的不断发展,趟来越多的物种被测序，获得了大量物种的基因组信息。研究人员所遇到的问题是如何利用生物信息学分析庞大的数据，找到在代谢途径、基因表达调控机制和信号转导途径中起调节作用的基因，并对这些基因进行分析和研究。通过使用基因芯片技术能够实现高通量筛选差异基因的目的。基因芯片技

2、术是随着人类基因组计划逐渐发展成熟的，通过基因芯片技术蹄选基因的效率远远高于传统蹄选基因的方法，大大缩短了实验时间和流程，减少了研究人员的工作量，加快了实验进程。基因芯片技术也为基因组学[3，4]和蛋白质组学[5>6]的研究提供了有力的研究工具，推动了这两个领域的研究进展。基因组水平上基因的表达水平及变化，能被基因芯片速、高效、高通量的检测到。能为研究人员基因表达检测、寻找新基因、单核苷酸多态性检测及基因组比较分析[1G]提供帮助，在工业中的药物蹄选和新型药物开发提供帮助⑴，在癌症和艾滋病

3、的检测中也有良好的应用，同时在环境保护、司法鉴定等领域取得了较好的应用。1.2实时焚光定量技术实时焚光定量PCR的监控是一个实时动态的过程。整个过程分为3个时期，基线期，指数期，平台期，如图1-2所示。在基线期，扩增反应产生的焚光信号值与突光背景信号值相当，无法判断产物的变化。而在平台期，反应体系中的扩增反应达到动态平衡，扩增产物的量与模板的量之间没有线性关系。只有在指数期，实时焚光定量的理论方程才能成立，产物的对数值与起始模板之间存在线性关系。在实时焚光定量中，一个重要的概念是a值，是指每个反

4、应管内的突光信号达到所设定的阈值时所要经历的循环数。Ct值与模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。而闽值（Threshold)般以PCR反映前期15个循环的焚光信号作为焚光本底信号（baseline)，不同的模板Ct值不同。当检测到的焚光信号超过了阈值则被认为是真正的信号[42]。qRT-PCR是在反应体系中加入突光染料，以此监控PCR的循环反应。根据加入染料的不同，可以分为两种类型的焚光定量方式：非特异性焚光定量PCR和特异性荧光定量PCR。焚光定量的方法的比较如表1

5、所示。非特异性突光定量PCR:是指在反应体系中加入SYBRGreen染料的qRT-PCR方法。SYBRGreen可以与双链DNA结合并发出绿色焚光在游离状态下，SYBRGreen只会发出微弱的突光，当它结合在双链DNA的小沟时，能激发出强烈的焚光。釆用SYBRGreen的qRT-PCR实验简单，仅需要设计出两个引物，无需设计探针，可以在多次实验中检测不同的基因，通用性较好，成本低，通过融解曲线分析检验扩增反应的特异性。SYBRGreen能与所有的双链DNA结合，同时由于引物二聚体，以及单链二级结

6、构，扩增错误等，会增加焚光值,致使不能形成锐利单峰融解曲线，因此不能进行多重PCR反应。第二部分材料与方法2.1实验材料根据候选内参基因的NM号，在NCBI的数据库获取与之相对应的mRNA序列。使用NCBI引物设计工具，Primer-Blast进行设计，并使用Blast程序对引物序列进行特异性检验。由于Primer-Blast是基于Primer3[9i]程序的修改版本，所以可以使用作为引物设计的补充，并且Primer3phis有一个专门设计qRT-PCR引物的功能。在引物设计中所需的具体参数，可

7、参考Udvardi等人的焚光定量的11条黄金准则[93]，Apte等人的PCR引物设计准则[94]，Li等人的所著的RT-PCR协议一书中的第十八章节RT-PCR的引物设计[95]进行调整。本研究中使用图2-1中的流程进行引物设计，将候选内参基因的mRNA分别在NCBIPrimer-Blast和Primer3Plus中进行引物设计。将得到的引物序列通过NCBIBlast中进行引物验证，在MaizesequenceBlast中进行引物的电子克隆。通过引物的期望值E-value和扩增片段的唯一性，评

8、判引物的特异性。将所获得的引物通过PrimerRankTool[96]排序后，最终获得本次研究所需的候选内参基因的引物。2.2实验方法2.2.1基因芯片数据收集从NCBI的GEO数据库禾口EBI(EuropeanBioinformaticsInstitute)的ArrayExpress数据库中下载Afifymetrix公司的AffymetrixMaizeGenomeArray(基于GPL4032系列的基因芯片）玉米芯片数据。ExpressionConsole软件是Afifymetrix公司幵发的